中国产家蚕抗菌肽A基因部分序列的测定

从大肠杆菌感染的家蚕蛹提取RNA,用RT-PCR方法扩增未知抗菌肽基因片段,经过克隆测序,获得了蚕抗菌肽A基因的部分片段164 bp,为制备蚕抗菌肽A基因探针,筛选基因文库打下了基础.     

蒙古冰草磷脂酶D基因cDNA 3'端的克隆及分析

目的：采用3’RACE方法对蒙古冰草磷脂酶D（PLD）基因3’端全序列进行了快速扩增和序列分析,为得到全序列及研究该基因的功能奠定基础。方法：实验以蒙古冰草幼叶为材料,利用RT-PCR技术得到PLD基因的部分cDNA序列,根据此序列设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即M13PrimerM4作为下游引物,按3’RACE试剂盒（TaKaRa）操作流程进行PLD基因3’末端的快速扩增,成功获得993bp的3’RACE反应产物,采用DNAStar软件对扩增的PLD基因的3’RACE产物和中间片段进行拼接,最终获得2113bp的PLD基因3’端cDNA序列。结果：通过BLAST技术,发现该片段与许多植物磷脂酶D基因的同源性为47.0%～80.0%。结论：通过同源性比较,成功克隆了PLD基因cDNA3’端序列。     

简并PCR结合RACE技术克隆申克孢子丝菌未知过氧化氢酶基因

目的 克隆孢子丝菌未知过氧化氢酶基因,命名为Sscat基因.方法 根据生物信息库中7种已知真菌过氧化氢酶氨基酸序列的高度保守区域设计简并引物,PCR扩增获得部分Sscat基因cDNA片段,随后应用RACE技术分别扩增其3’端和5’端未知序列.结果 Sscat基因cDNA序列全长1746 bp,其中包括5’端121 b...     

中国野蚕一种强抗病毒蛋白的基因分析和活性鉴定

以最近报道的家蚕抗病毒蛋白基因为线索,从中国野蚕（Bombyx mandarina Moore）中肠内克隆了抗家蚕BmNPV病毒的SP-2 cDNA（GenBank登录号：AY945210）,基因大小855bp,编码284个氨基酸的蛋白质,分子量29．6kD,基因组全长1376bp,包含5个外显子和4个内含子．该基因的表达仅限于中肠,具有组织特异性,在幼虫龄中表达水平较高,而在眠期和熟蚕没有表达．推导其氨基酸序列,发现其C端氨基酸序列与已报道的家蚕相应序列差别较大,有8个氨基酸完全不同．通过体外重组技术,由高效基因表达系统获得大量重组蛋白,发现该蛋白具有很强的抗家蚕BmNPV活性,与家蚕对应的抗病毒蛋白BmSP-2相比,其抗BmNPV活性高1．6倍．初步认为,该蛋白质C端序列差异可能是造成家蚕与野蚕抗病毒活性差别的主要原因．     

家蚕Caspase家族基因 BmCaspase-X 的克隆与功能分析

【目的】本研究旨在克隆获得家蚕 Bombyx mori Caspase家族基因,并通过RNAi技术初步分析其在家蚕细胞水平细胞凋亡中的功能。【方法】 用cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆家蚕Caspase家族一个新基因,用RNAi和流式细胞术初步分析该基因在家蚕细胞凋亡中的功能。【结果】将克隆获得的家蚕Caspase家族基因命名为 BmCaspase-X,其全长为2 105 bp,开放阅读框长为1 494 bp,编码497 aa,分子量为57.8 kDa,等电点为5.29。BmCaspase-X含有Caspase特有的结构位点。系统进化分析表明,BmCaspase-X与家蚕ICE同其他昆虫Caspase-4同源物先聚在一起,再与具有长前体结构域的昆虫其他因子聚为一类。RNAi初步结果显示该基因干扰后没有出现明显的细胞凋亡。【结论】BmCaspase-X具有典型Caspase特征,属于Caspase家族成员。目前RNAi实验结果表明 BmCaspase-X 未能引起家蚕细胞凋亡的改变。本文为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

“两广二号”家蚕抗病毒基因Bmlipase-1和BmSP-2克隆与原核表达

本研究以优良杂交品种"两广二号"家蚕为试材,克隆了该杂交品种家蚕两个抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因:脂肪酶基因Bmlipase-1和丝氨酸蛋白酶基因BmSP-2,测序并分别与不同品种蚕的同源基因序列进行比较。结果显示,"两广二号"家蚕Bmlipase-1基因ORF长度为885bp,编码294个氨基酸,BmSP-2扩增长度为855bp,编码284个氨基酸;它们的核苷酸和推导氨基酸序列同源性皆达92%以上,Bmlipase-1更保守,同源性大于99%";两广二号"家蚕的Bmlipase-1基因脂肪酶活化部位和BmSP-2基因酶催化三联体位点的氨基酸残基与不同品种蚕的完全相同。以上结果说明这两个抗病毒基因在蚕的遗传进化过程中高度保守,提示其可能在机体消化或者免疫防御方面起着重要生理作用。将这两个抗病毒基因在大肠杆菌BL21中进行融合表达,获得的融合Bmlipase-1和BmSP-2蛋白分子量分别为47kD和42kD左右。     

一个巴西橡胶树钙调素基因假基因的识别

以巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)基因组DNA为模板,根据胶乳钙调素基因HbCaM序列设计引物,利用PCR方法克隆获得了1 319 bp和447 bp的两个DNA片段.序列分析表明,1 319 bp的DNA长片段为胶乳钙调素基因HbCaM的DNA片段,含有两个外显子(77 bp和373 bp)和1个内含子(869 bp),包含了HbCaM cDNA编码区447 bp的全部序列;447 bp的DNA小片段与HbCaM cDNA核苷酸序列同源性高达98%,ORF分析发现,位于406?bp处的碱基C突变为T,即三联体密码CAG突变为终止子TAG使翻译提前终止,其余5个差异碱基都不影响或改变正常的翻译.推测此447 bp的DNA片段为巴西橡胶树钙调素HbCaM基因的假基因,命名为HbCaMP1.     

少棘蜈蚣毒腺RACE cDNA文库的构建及β-actin基因的克隆与序列分析

运用SMART技术首次构建了少棘蜈蚣(Scolopendrasubspinipes)毒腺cDNA文库。经琼脂糖电泳检测,文库所含全长cDNA主要分布在5 0 0bp以上,大于2 0 0 0bp的区域尚有很长拖尾,中间有几条高丰度mRNA亮带。以此文库为模板,通过5′RACE(RapidamplificationofcDNAends,快速扩增cDNA末端)方法获得了细胞质肌动蛋白βactin基因5′末端5 98bp片段,其中包括开放阅读框5 46bp ,编码1 82个氨基酸。将该基因片段推导的氨基酸序列通过BLAST软件与蛋白质公共数据库Swissprot比对,发现与蜜蜂(Apismellifera)的βactin基因同源性高达96% ,说明本实验所构文库质量完全可以满足用RACE方法进行功能基因的cDNA克隆。通过基于双参数模型的NJ法对部分动物βactin基因进行系统重建,较好地反映了这些动物的系统发生关系。     

油莎豆PEPCase基因ppc的克隆及初步分析

[目的]油莎豆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的分子克隆及初步分析。[方法]通过对Gen Bank中其他植物PEPCase基因进行同源性比对,设计简并性引物,用PCR法克隆获得PEPCase编码基因ppc的两个片段S1和S2。[结果]S1、S2片段长度分别为577 bp和190 bp,生物信息学分析表明,S1片段全部位于ppc基因第8外显子区域,S2片段包含ppc基因第8外显子3’端序列,第9外显子5’端序列以及它们之间的内含子区域。[结论]S1、S2片段长度分别为577 bp和190 bp。Blast比对结果表明,油莎豆ppc基因S1S2全长片段与Cyperus ustulatus(PEPC-C4-1)、Cyperus longus、Cyperus iria和Cyperus papyrus的同源性均为97%,与Cyperus rotundus同源性为96%。进化树分析结果表明,油莎豆ppc基因S1和S2片段与莎草属Cyperus ustulatus、Cyperus longus、Cyperus iria等的ppc基因的进化亲缘关系最近。