2.2埃分辨率B链N端去三肽猪胰岛素(DesB1-3INS)的晶体结构研究

应用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ技术和立体化学制约最小二乘精化技术,测定了２．２Ａ。分辨率ＤｅｓＢ１－３ＩＮＳ的晶体结构。晶体属于Ｒ３空间群。精化后的结构模型最终Ｒ因子为０．１７８,同标准键长、键角的均方根偏差分别为０．０１７Ａ。和２．９９°。从电子密度图与模型的拟合来看,独立区内两个分子Ｂ链Ｎ端残基的表现十分清晰,相对于三方二锌猪胰岛素的两个分子,ＤｅｓＢ１－３ＩＮＳ分子Ｉ中Ｂ链Ｎ端的构象发生了变化     

分子置换法在去B链羧端五肽胰岛素晶体结构测定中的应用

收集了一套去B链羧端五肽胰岛素(DPI)单斜晶体的X射线衍射数据。利用已知的胰岛素结构和DPI强度数据,应用分子置换法对测定DPI的晶体结构作了尝试。为了测定分子在晶胞中的取向和位置,在TQ-16和013计算机上编制了一套ALGOL程序。在算得的旋转函数图上没有找到突出的峰,用去掉B链前三个氨基酸残基和大部分表面侧链的胰岛素分子的原子坐标数据作试验,得到了改进的10～4图。在此基础上,采用不同的方法探索分子在单斜晶胞里的位置,最后得到了一个可能的分子在晶胞里的堆积模型。结果表明,胰岛素和DPI分子结构之间的差异可能较大,DPI晶体中晶体学二重轴联系的两个分子不能形成一个象三方二锌猪胰岛素晶体那样的二聚体。     

分子置换法在去B链羧端五肽胰岛素晶体结构测定中的应用

收集了一套去B 链羧端五肽胰岛素(DPI)单斜晶体的X 射线衍射数据。利用已知的胰岛素结构和DPI 强度数据,应用分子置换法对测定DPI 的晶体结构作了尝试。为了测定分子在晶胞中的取向和位置,在TQ-16和013计算机上编制了一套ALGOL 程序。在算得的旋转函数图上没有找到突出的峰,用去掉B 链前三个氨基酸残基和大部分表面侧链的胰岛素分子的原子坐标数据作试验,得到了改进的10～4(?)图。在此基础上,采用不同的方法探索分子在单斜晶胞里的位置,最后得到了一个可能的分子在品胞里的堆积模型。结果表明,胰岛素和DPI分子结构之间的差异可能较大,DPI 晶体中晶体学二重轴联系的两个分子不能形成一个象三方二锌猪胰岛素晶体那样的二聚体。     

2．5分辨率单斜Al－（L－丙氨酸）胰岛素晶体结构研究

空间群为Ｐ２１的Ａ１－（Ｌ－丙氨酸）胰岛素晶胞内,一个不对称单位含有一个六聚体,应用差值Ｆｏｕｒｉｅｒ技术,立体化学制最小二来技术和Ｘ—ＰＬＯＲ程序并辅以电子密度图的人工拟合,解析了分辨率ＡＩ—（Ｌ－丙氨酸）胰岛素（Ａｌ－Ｌ－ＡｌａⅠ）的晶体结构。最终Ｒ因子为２０．６％,与标准键长与键角的均方根偏差分别为和４．１９°,从电子密度图与模型的拟合来看,六聚体中每条Ａ链的Ａｌ位置替换的Ｌ—Ａｌａ清晰可见,每条Ｂ链Ｎ端Ｂ１—Ｂ８伏段都为α螺旋构象,形成了Ｂ１—Ｂ１９的连续α螺旋段。     

2．5分辨率单斜Al－（L－丙氨酸）胰岛素晶体结构研究

空间群为Ｐ２１的Ａ１－（Ｌ－丙氨酸）胰岛素晶胞内,一个不对称单位含有一个六聚体,应用差值Ｆｏｕｒｉｅｒ技术,立体化学制最小二来技术和Ｘ—ＰＬＯＲ程序并辅以电子密度图的人工拟合,解析了分辨率ＡＩ—（Ｌ－丙氨酸）胰岛素（Ａｌ－Ｌ－ＡｌａⅠ）的晶体结构。最终Ｒ因子为２０．６％,与标准键长与键角的均方根偏差分别为和４．１９°,从电子密度图与模型的拟合来看,六聚体中每条Ａ链的Ａｌ位置替换的Ｌ—Ａｌａ清晰可见,每条Ｂ链Ｎ端Ｂ１—Ｂ８伏段都为α螺旋构象,形成了Ｂ１—Ｂ１９的连续α螺旋段。     

胰岛素B链N端和C端缩短对其与胰岛素抗体结合力的影响

本文研究了B链N端和C端缩短的若干胰岛素类似物与胰岛素抗体的结合能力。结果表明:去B链C端五肽胰岛素(DPI)分子中B_1-Phe去除后其与胰岛素抗体结合力明显下降,这与去B_1-Phe胰岛素与胰岛素抗体结合力下降的趋势相似;去B链C端六肽胰岛素(DHI)与胰岛素抗体结合力与DPI非常接近,都为胰岛素的70%左右。而去B链C端七肽胰岛素(DHPI)与胰岛素抗体结合力与去B链C端六肽胰岛素(DHI)相比,其结合力下降了一个数量级。说明胰岛素B_1-和B_(24)-Phe残基对组成和维持胰岛素分子的抗原决定簇起着重要作用。去B链九肽胰岛素(DNI)与胰岛素抗体的结合力与去B链C端八肽胰岛索(DOI)及DHPI相似。本文对上述结果进行了讨论。     

胰岛素分子中的非螺旋氢键

以差值傅里叶技术对同晶置换途径测定的胰岛素结构进行精化后,用蛋白质分子内环境分析程序考查了胰岛素分子的非螺旋氢键。结果表明,几乎所有非螺旋氢键都集中分布在B链N端(B4～B6)和C端(B20—B26)伸展肽段,A链两段螺旋间的4肽(A9—A12)和C端5肽(A17—A21),及其之间。它们包括,A链和B链自身形成的氢键3对,A链与B链之间的氢键5对,侧链与主链间的氢键5对,以及分子间的氢键4对。它们对于胰岛素分子精细构象的形成和稳定,特别对于B链C端(B20—B26)肽段的特征折迭和A—B链的正确三维相关,具有重要作用。运用非螺旋氢键分析的结果,讨论了它们在蛋白质结构中可能的一般性作用,以及胰岛素C端和N端一系列修饰物结构-功能研究的结果,提出了胰岛素分子的二聚化及胰岛素原的C肽可能对分子的特征三维折迭具有保护性作用的看法。     

胰岛素分子中的非螺旋氢键

以差值傅里叶技术对同晶置换途径测定的胰岛素结构进行精化后,用蛋白质分子内环境分析程序考查了胰岛素分子的非螺旋氢键。结果表明,几乎所有非螺旋氢键都集中分布在B链N端(B4—B6)和C端(B20—B26)伸展肽段,A链两段螺旋间的4肽(A9—A12)和C端5肽(A17—A21),及其之间。它们包括,A链和B链自身形成的氢键3对,A链与B链之间的氢键5对,侧链与主链间的氢键5对,以及分子间的氢键4对。它们对于胰岛素分子精细构象的形成和稳定,特别对于B链C端(B20—B26)肽段的特征折迭和A—B链的正确三维相关,具有重要作用。运用非螺旋氢键分析的结果,讨论了它们在蛋白质结构中可能的一般性作用,以及胰岛素C端和N端一系列修饰物结构-功能研究的结果,提出了胰岛素分子的二聚化及胰岛素原的C肽可能对分子的特征三维折迭具有保护性作用的看法。     

B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素晶体结构的分子置换法研究

以B链羧端去五肽胰岛素(DPI)结构为模型,应用分子置换法对B链N端去二肽(B1～2)C端去五肽(B26～30)胰岛素(DesB1～2DPI)晶体结构进行了研究.DesB1～2DPI晶体单位晶胞中每个结晶学不对称单位包含1个DesB1～2DPI分子.交叉旋转函数和平移函数搜索均找到了明显突出的峰,确定了DesB1～2DPI分子在晶胞中的取向和位置.进一步的三维模型重建和结构精化结果巩固了DesB1～2DPI的分子置换法研究的正确性.     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N 端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C 端片段除“工”字肽的免疫活力比A 链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A 链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N 端区域比C 端重要。同样,B 链可能比A 链重要。     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C端片段除“工”字肽的免疫活力比A链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N端区域比C端重要。同样,B链可能比A链重要。     

[Trp]~(B_1)胰岛素结构研究——Ⅱ.差值傅立叶法结构分析

在四圆衍射仪上收集了猪和牛[Trp]~(B_1)胰岛素单晶体3.1埃分辨率的衍射数据,并计算获得了这两个胰岛素类似物对猪胰岛素的差值电子密度图。这两套图的特点基本上相似,B_1-Trp残基附近密度变化较大,从密度的形状与连续性看来,在不对称单位的两个分子中,分子I 的色氨酸侧链似乎指向分子内部。在本文的最后部分对所得到的结果作了讨论。     

[Trp]~(B_1)胰岛素结构研究——Ⅱ.差值傅立叶法结构分析

在四圆衍射仪上收集了猪和牛[Trp]~(B_1)胰岛素单晶体3.1埃分辨率的衍射数据,并计算获得了这两个胰岛素类似物对猪胰岛素的差值电子密度图。这两套图的特点基本上相似,B_1-Trp残基附近密度变化较大,从密度的形状与连续性看来,在不对称单位的两个分子中,分子Ⅰ的色氨酸侧链似乎指向分子内部。在本文的最后部分对所得到的结果作了讨论。     

经各向异性温度因子修正后的1.2A分辨率的猪胰岛素晶体结构——温度因子的结构信息,水分子,氢原子和氢键体系

本文主要报道在1.2(?)高分辨率利用限制立体化学参数的倒易空间最小二乘技术对胰岛素的非氢原子进行各向异性温度因子修正后的结果。在修正后的电子密度图上,少数原子电子密度的各向异性分布有明显表现;80％的氢原子的电子密度有不同程度的反映;修正建立的包括水和溶剂体系,氢原子和氢键在内的胰岛素分子的精确结构模型,为各种胰岛素类似物结构的分析和比较,以及结构与功能关系的研究提供了可靠的,精度的参照和基础。     

反相高效液相层析在胰岛素结构与功能研究中的应用

采用一种简单的“甲醇-水-0.1％三氟醋酸”作为洗脱体系的反相高效液相层析对研究胰岛素结构与功能关系,以及A链和B链相互作用时所用的一些胰岛素衍生物进行了快速、灵敏、准确的分析和鉴定。 胰岛素的S-磺酸型A链和B链只经一次离子交换层析纯化,经鉴定结果表明是均一的。S-硫甲基型A链和B链基本上也是均一的。通过对胰岛素还原产物的分析确定了能保证胰岛素折分完全并对其重组较为有利的还原条件。去B链羧端五肽(B26—30)胰岛素,以及去B链羧端八肽(B23—30)胰岛素能同时与天然胰岛素清楚地分离。一级结构差别极小的猪胰岛素和牛胰岛素也可得到分辨。胰岛素的羧端缩短的B链和A链重组的定量分析表明B链羧端肽段不但对胰岛素分子的生物活力的体现,而且在A链和B链的正确重组中都起着重要的作用。     

胰岛素晶体中水的一般结构及作用

在1.8A分辨率胰岛素同晶置换结构的基础上,运用差值付里叶技术研究了胰岛素晶体中水的结构和作用。晶胞中大约三分之一的水呈结合状态,它们与胰岛素分子彼此以氢键结合。在差值图上,这部分水分子表现清晰而肯定,显示出有序状态。胰岛素分子A、B链各氨基酸残基的极性和荷电基团,除已经彼此以氢键或盐键形成给体-受体“配偶”者和处于分子内部者外,其余几乎都与水分子相结合。蛋白质分子表现出最大限度结合水的倾向。一些水桥和水网络作用于胰岛素分子的A、B链之间和二聚体之间,对胰岛素分子A、B链的正确相关以及二聚化和六聚化都有重要意义。显然通过水分子的作用,使极性和荷电基团形成最大限度的给体-受体“配偶”,是稳定蛋白质三维结构的一个重要因素。大约三分之二的水分子,围绕胰岛素分子形成近似“水合层”的结构。它们在差值电子密度图上,表现弱而弥散,显示出是一些有序性较差的分子。通过结合水在蛋白质分子表面形成一些“抛锚点”,可能是这类水与蛋白质分子相作用的一条途径。它们较大的游动性,对蛋白质分子的动力学性质可能有重要意义。     

胰岛素晶体中水的一般结构及作用

在1.8分辨率胰岛素同晶置换结构的基础上,运用差值付里叶技术研究了胰岛素晶体中水的结构和作用。晶胞中大约三分之一的水呈结合状态,它们与胰岛素分子彼此以氢键结合。在差值图上,这部分水分子表现清晰而肯定,显示出有序状态。胰岛素分子A、B链各氨基酸残基的极性和荷电基团,除已经彼此以氢键或盐键形成给体-受体“配偶”者和处于分子内部者外,其余几乎都与水分子相结合。蛋白质分子表现出最大限度结合水的倾向。一些水桥和水网络作用于胰岛素分子的A、B链之间和二聚体之间,对胰岛素分子A、B链的正确相关以及二聚化和六聚化都有重要意义。显然通过水分子的作用,使极性和荷电基团形成最大限度的给体-受体“配偶”,是稳定蛋白质三维结构的一个重要因素。大约三分之二的水分子,围绕胰岛素分子形成近似“水合层”的结构。它们在差值电子密度图上,表现弱而弥散,显示出是一些有序性较差的分子。通过结合水在蛋白质分子表面形成一些“抛锚点”,可能是这类水与蛋白质分子相作用的一条途径。它们较大的游动性,对蛋白质分子的动力学性质可能有重要意义。     

长效胰岛素的分子设计研究

以工程化制备由分子内在因素制导的可溶性长效胰岛素为目标,提出以“增加次级键,稳化寡聚体”原理,用以减缓注射进入体内的胰岛素六聚体的解聚速率,形成能持续供应胰岛素单体的“库”,从而获得长效作用。据此以精确的胰岛素三维结构为基础,进行了分子设计和计算机模拟,提出了对胰岛素的B链c端和N端修饰产生长效性的分子改造方案,重点分析了B2Lys/Arg和B31Lys/Arg胰岛素。用化学半合成制备的上列二种胰岛素,生物学测试表明确有长效性。2埃分辨率B31-Arg人胰岛素晶体结构的测定显示了Arg-B31与相邻分子Glu-B21间存在一对附加氢键作为长效效应的主要结构基础,证实分子设计思想的基本正确性。     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。     

胰岛素类似物的内源萤光光谱

为了进一步了解胰岛素构象与功能的关系,测定了不同条件下胰岛素和它的类似物的内源萤光光谱,胰岛素类似物包括去B链羧端五肽胰岛素,去B链羧端七肽胰岛素和去B链羧端八肽胰岛素。它们的发射光谱的峰在306nm,激发光谱峰在277nm。不同pH值,不同浓度的十二烷基硫酸钠和温度变化对胰岛素的荧光光谱的影响和对类似物的影响非常相似。说明这些类似物的环境酪氨酸残基的微环境是相似的。由于去五肽胰岛素有接近于天然胰岛素的生物活力,去七肽胰岛素没有生物活力,因此说明,胰岛素分子的受体结合部位中,B_(24～25)两个苯丙氨酸侧链本身具有重要的地位。并不是因为失去它们后引起胰岛素构象变化而失活的。