猪链球菌2型Ⅳ型分泌系统组分VirD4与毒力相关性分析

摘要:【目的】构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33毒力岛89 K上的Ⅳ型分泌系统组分VirD4敲除突变株,初步分析其活性和毒力,为进一步研究猪链球菌2 型在逃避宿主天然免疫杀伤中的作用提供基础。【方法】以05ZYH33基因组为模板,PCR扩增VirD4基因上下游同源臂,以穿梭质粒pSET1为模板,PCR扩增氯霉素抗性基因Cm,通过重叠PCR技术搭建上述3个片段并连接至温敏载体pSET4s,构建基因敲除载体pSET4s∷VirD4;通过同源重组构建基因敲除突变株ΔVirD4;通过体外全血杀伤实验、CD1小鼠竞争感染及攻毒实验 对突变株和野生株的毒力进行比较分析。【结果】获得了基因敲除突变株ΔVirD4,通过对比发现其毒力与野生株相比有所降低。【结论】猪链球菌2型Ⅳ型分泌系统组分VirD 与其毒力相关,并在早期抵抗天然免疫细胞杀伤中发挥一定作用。     

猪链球菌2型ABC转运蛋白gene0910敲除突变体的构建及活性分析

目的:构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH3389K毒力岛上的ABC转运蛋白gene0910敲除突变体,并初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以猪链球菌2型05ZYH33基因组为模板,扩增gene0910两侧各约500bp左右的片段为上下游同源臂,以pSET1质粒为模板,扩增氯霉素抗性基因Cm为中间片段,采用重叠PCR方法搭建三个片段,并克隆到自杀载体pSET4S上,构建基因敲除的载体。电转化05ZYH33感受态细胞,经30℃双交换和40℃质粒丢失,最后点板法筛选出基因敲除突变体△0910。对突变株和野生株的生物学活性及小鼠的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示gene0910完全被氯霉素抗性基因Cm所替代,基因敲除突变体构建成功。结论:突变株的生物学活性和对小鼠的致病性与野生株相比差异不显著。     

2型猪链球菌gene0969基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33毒力岛89K上的Ⅳ型分泌系统组分gene0969敲除突变体,初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以05ZYH33基因组为模板,PCR扩增gene0969基因的上下游片段;以穿梭质粒pSET1为模板,PCR扩增氯霉素抗性基因Cm;采用重叠PCR方法搭建3个片段,并克隆到自杀载体pSET4s上,构建基因敲除载体,通过同源重组构建gene0969突变体,再用小鼠感染模型对突变株和野生株的毒力进行比较。结果:获得了gene0969基因敲除突变体,并发现其毒力与野生型相比有下降趋势。结论:2型猪链球菌假想毒力因子gene0969可能与毒力有关,其作用和机制值得进一步分析。     

猪链球菌2型05Z33强毒株转录调控因子Rgg基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg的基因敲除突变体,观察其生物学性状,并在动物感染实验中比较敲除株与野生株的毒力差异,为进一步研究猪链球菌转录调控因子在致病中的作用提供实验基础。方法:分别以猪链球菌2型05ZYH33基因组和pSET1质粒为模板,扩增基因SSU05_1997两侧各约500 bp的片段为上下游同源臂,氯霉素(Cm)抗性基因为中间片段,采用重叠PCR方法连接3个片段;连接产物先克隆到T载体上,再经过酶切克隆到温度敏感自杀载体pSET4S上;将构建的基因敲除载体pSET4S-1997电转化入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度筛选出基因敲除突变体05Z33△rgg;对敲除株和野生株的生物学性状及小鼠和猪的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示基因SSU05_1997完全被Cm抗性基因所替代,基因敲除突变体构建成功;05ZYH33△rgg对小鼠和猪的致病性与野生株相比无明显差异。结论:转录调控因子Rgg可能和猪链球菌2型的毒力无关。     

2型猪链球菌MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33中MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除的突变株,探索SSU0562基因缺失对细菌基本生物学特性和毒力的影响。方法:构建左右两侧为SSU0562基因上下游的同源序列,中间部分为壮观霉素抗性基因(Spcr)的基因敲除质粒,通过同源重组的方法筛选SSU0562基因敲除突变株Δ0562。对突变株与野生株的基本生物学特性进行系统的比较分析,并且将小鼠作为动物感染的模型来研究突变株的毒力。结果:组合PCR的分析及基因测序结果均表明Spcr完全取代了S.suis2中SSU0562基因位点,表明基因敲除突变体Δ0562构建成功,反转录PCR(RT-PCR)证实了突变株Δ0562中SSU0562基因在转录水平的缺失;在溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力方面,突变株Δ0562与野生株05ZYH33相比均无显著差别,然而革兰染色实验显示突变株Δ0562的成链能力明显减弱。结论:猪链球菌强毒株05ZYH33的毒力并未因SSU0562基因的缺失而发生显著性改变,表明SSU0562基因并非猪链球菌的毒力决定因子,但很有可能参与猪链球菌成链能力的调控。     

高致病性2型猪链球菌IV型样分泌系统virB1-89K基因的敲除及其对毒力的影响

摘要:【目的】构建高致病性2 型猪链球菌IV 型样分泌系统virB1-89K基因的敲除株和互补株,研究virB1-89K基因缺失对细菌毒力的影响。【方法】通过同源重组技术敲除virB1-89K基因,多重PCR筛选敲除株并测序鉴定。再将virB1-89K基因克隆到穿梭质粒pSET1后转入virB1-89K敲除株中,构建互补株。比较野生株05 ZYH33、突变株△virB1-89K和互补株CvirB1-89K三者基本生物学特性的差异,小鼠实验分析virB1-89K基因敲除后对细菌毒力的影响。【结果】成功构建突变株△virB1-89K和互补株CvirB1-89K,在基本生物学性状无明显改变的情况下,敲除株的毒性降低到野生株的30%,互补株可恢复其毒性。【结论】virB1-89K基因作为2型猪链球菌高致病性菌株05 ZYH33的IV样分泌 系统的重要组分,与其高致病性密切相关。     

高致病性2型猪链球菌Ⅳ型样分泌系统virB1-89K基因的敲除及其对毒力的影响

[目的]构建高致病性2型猪链球菌Ⅳ型样分泌系统vir B1-89K基因的敲除株和互补株,研究vir B1-89K基因缺失对细菌毒力的影响.[方法]通过同源重组技术敲除vir B1-89K基因,多重PCR筛选敲除株并测序鉴定.再将virB1-89K基因克隆到穿梭质粒pSET1后转入vir B1-89K敲除株中,构建互补株.比较野生株05ZYH33、突变株△virB1-89K和互补株CvirB1-89K三者基本生物学特性的差异,小鼠实验分析virB1-89K基因敲除后对细菌毒力的影响.[结果]成功构建突变株△vir B1-89K和互补株CvirB1-89K,在基本生物学性状无明显改变的情况下,敲除株的毒性降低到野生株的30％,互补株可恢复其毒性.[结论]virB1-89K基因作为2型猪链球菌高致病性菌株05ZYH33的Ⅳ样分泌系统的重要组分,与其高致病性密切相关.     

2型猪链球菌SSU0448基因敲除突变株的构建及其毒力分析

【目的】 通过构建2型猪链球菌(SS2)强毒株05ZYH33的SSU0448基因缺失突变株Δ0448和互补株CΔ0448,探索SSU0448基因缺失对细菌基本生物学特性和细菌毒力的影响。【方法】用同源重组基因敲除方法构建筛选强毒株05ZYH33中N-乙酰半乳糖胺和半乳糖胺代谢途径相关转录调节因子SSU0448基因的缺失突变株,比较分析突变株Δ0448与野生株05ZYH33、互补株CΔ0448的基本生物学特性,小鼠毒力实验分析SSU0448基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】PCR检测分析显示,SSU0448基因在转化重组体中被壮观霉素抗性基因所替代,表明基因敲除突变株构建成功;同时构建了基因功能互补株CΔ0448。生物学特性实验表明突变株Δ0448在成链能力上较野生株明显减弱,对数生长期稍短,快速到达平台期;而菌落形态、革兰氏染色和溶血活性方面无明显差异;小鼠毒力实验发现,突变株毒力并无显著改变。【结论】SSU0448基因的敲除能够改变2型猪链球菌的成链能力;不影响其侵袭致病能力,可能延缓2型猪链球菌的发病过程,此研究为2型猪链球菌致病感染奠定了基础。     

猪链球菌2型强毒株sly基因敲除株构建及生物学特征分析北大核心

[目的]构建猪链球菌2型05ZYH33溶血素sly基因敲除突变株,比较突变株与野生株生物学特征。[方法]分别克隆sly上游序列L、下游序列R和壮观霉素抗性基因spcr,构建基因敲除质粒p UC18-LSR,并电转化入05ZYH33感受态细菌。用多重PCR、RT-PCR及Southern杂交对sly基因敲除突变株进行鉴定。比较突变株与野生株的生长速率和溶血现象。[结果]多重PCR和RT-PCR分别显示,野生株DNA和c DNA都能扩增出579 bp的sly内部片段,而突变株DNA和c DNA都未能扩增出此片段。Southern杂交显示,突变株中未见sly探针杂交条带。突变株生长速率较野毒株迟缓,溶血能力减弱,但依然存在。[结论]建立了高效稳定的电转化方法,成功构建出溶血能力减弱的双交换同源重组sly基因敲除突变株。     

2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33 sao基因敲除突变株的构建及其生物学功能

构建2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)中国强毒株05ZYH33的sao基因敲除突变株。构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为sao编码基因上下游同源序列的基因敲除载体,同源重组筛选sao基因敲除突变株。PCR、RT-PCR、Western Blot对疑似突变株进行验证,实验结果均证实sao基因完全被spc抗性基因替代,成功构建了突变株05ZYH33-sao。对野生型菌株和突变株进行菌落溶血活性、生长特性、小鼠致病性比较,结果表明sao基因的敲除并未使野生型菌株在以上三方面产生明显的变化。筛选获得的05ZYH33 sao基因突变株为进一步研究sao基因在05ZYH33致病过程中的作用奠定了基础。     

猪链球菌2型唾液酸合成酶neu B基因敲除突变株的构建及其生物学特性

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33唾液酸合成酶neuB基因敲除突变株。PCR和Southern杂交结果均显示neuB基因在1株转化重组体中完全被壮观霉素抗性基因替代, 表明neuB基因敲除突变体构建成功。生物学特性鉴定显示, 突变体与强毒株在菌落形态、溶血活性以及染色特性方面均无明显差异; 电镜检查发现突变体表面结构组分与强毒株有显著差异, 荚膜明显变薄, 质地更加紧密; 小鼠致病性试验结果显示, 突变体毒力显著减弱。研究结果提示菌体荚膜中的唾液酸对于猪链球菌2型侵袭和致病具有重要作用。     

高致病性2型猪链球菌plcR基因敲除株的构建及其相关生物学特性的研究

【目的】构建高致病性2型猪链球菌05ZYH33菌株plcR基因敲除株,通过比较突变株与野生株生物学特性的差异,研究plcR基因在2型猪链球菌致病过程中的作用。【方法】利用同源重组技术敲除plcR基因,多重交叉PCR及RT-PCR鉴定并测序验证。比较野生株与突变株基本生物学特性的差异,小鼠攻毒实验分析plcR基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】经RT-PCR证实05SSU0241与05SSU0242共转录,通过多重交叉PCR及RT-PCR证实成功构建plcR基因缺失突变株,基本生物学特性显示突变株的生长速率、菌落形态、溶血活性均无显著改变,小鼠致病性试验结果显示,野生株攻毒的小鼠死亡率为70%,突变株攻毒的小鼠死亡率为40%,毒力较野生株显著降低。【结论】plcR基因作为2型猪链球菌有毒株基因组中特有的外源基因,在细菌致病过程中具有重要作用。     

猪链球菌2型菌毛骨架蛋白编码基因SSU2101敲除突变株的构建及其生物学功能

利用同源重组基因敲除方法构建猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2,S.suis2)中国强毒株05ZYH33菌毛骨架蛋白(Backbone protein,BP)编码基因SSU2101敲除突变株。采用引物特异性PCR分析、Southern杂交及RT-PCR等方法鉴定,证实成功构建了BP基因缺失突变株。生物学特性显示,突变株的菌落形态、溶血活性以及染色特性方面与野生株之间均无明显差异。小鼠致病性试验结果显示,突变株的毒力比野生株显著减弱。研究结果提示菌毛在S.suis2感染致病过程中起重要作用,为系统研究S.suis2菌毛分子装配机制及其生物学功能奠定了基础。     

Ⅱ型猪链球菌二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体的构建

构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体。构建中间为壮观霉素抗性基因, 两侧为2148hk/rr编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒, 通过同源重组筛选2148hk/rr编码基因敲除突变体。PCR分析和Southern杂交结果均显示2148hk/rr编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代, 基因敲除突变体构建成功。筛选获得05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体, 为阐明该调控系统在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础。     

Ⅱ型猪链球菌二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体的构建

构建猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体.构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为2148hk/rr编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选2148hk/rr编码基因敲除突变体.PCR分析和Southern杂交结果均显示2148hk/rr编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代,基因敲除突变体构建成功.筛选获得05ZYH33二元信号转导系统2148hk/rr基因敲除突变体,为阐明该调控系统在猪链球菌致病过程中的作用奠定了基础.     

高致病性2型猪链球菌截短型类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因的鉴定和功能研究

【目的】克隆表达高致病性2型猪链球菌05ZYH33株的SspA截短型基因,验证其是否具有酶学活性,并构建该基因的缺失突变株细菌,探讨其在2型猪链球菌致病过程中所起的作用【。方法】构建SS2的SspA截短型基因05SSU0811原核表达质粒,表达并纯化05SSU0811蛋白,运用丝氨酸蛋白酶底物Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(pNa),通过显色反应检测表达产物的酶学活性;运用同源重组技术敲除05SSU0811基因,多重交叉PCR筛选敲除株并测序鉴定,动物试验分析05SSU0811基因缺失对细菌毒力的影响。【结果】成功表达并纯化05SSU0811蛋白,浓度约为3.5 g/L。丝氨酸蛋白酶活性测定试验证实其具有酶学活性;获得05SSU0811基因缺失突变株,小鼠攻毒试验表明,野生株攻毒的20只小鼠全部死亡,基因缺失突变株攻毒组死亡9只,死亡率45%,两组间死亡率有显著性差异。表明05SSU0811基因缺失的菌株毒力较野生株明显下降。【结论】05SSU0811基因编码的截短型丝氨酸蛋白酶仍然具有酶学活性,SS2的截短型基因SspA在高致病性2型猪链球菌的致病性方面具有一定作用。