人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测

旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶(Csk)基因真核表达系统。从He La细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得Csk基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体p ENTER中,构建重组质粒p ENTER-Csk-his。重组质粒转染293T细胞48h后通过SDS-PAGE、Western blot检测Csk蛋白表达情况,间接免疫荧光进行蛋白定位,通过镍螯合的磁珠法纯化Csk蛋白,hispulldown及CO-IP检测表达蛋白的活性。结果显示,经双酶切及测序鉴定,真核表达载体p ENTER-Csk-his正确没有突变,SDSPAGE及Western blot均可检测到大小约为51 k D的目的蛋白,说明Csk蛋白在293T细胞中表达成功,间接免疫荧光定位重组Csk蛋白在细胞质中表达,通过磁珠纯化得到Csk蛋白,最后通过his-pulldown及CO-IP发现Csk能够与IGF1R、SHC1相互作用,说明表达的Csk蛋白具有生物学活性。成功获得Csk基因全长序列,并构建重组p ENTER-Csk-his真核表达质粒,在真核细胞293T的细胞质中获得高效表达且表达的蛋白具有生物学活性。     

奶牛SCAP基因的克隆,表达定位及对FASN基因启动子的转录调控

固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(srebpcieavage activating protein,SCAP)是细胞脂肪合成酶的表达调控因子。本研究旨在肝脏L02细胞中研究SCAP对FASN基因启动子的转录调控作用,有助于进一步明确SCAP/SREBP1对于靶基因的转录调控机制。本研究以荷斯坦奶牛组织c DNA为模板,克隆SCAP基因的编码序列,构建pc DNA3.1-SCAP表达载体,将SCAP表达载体转染L02肝脏细胞,采用荧光定量PCR检测SCAP基因m RNA在24 h、48 h、72 h的表达情况;采用免疫荧光的方法对SCAP标记,激光共聚焦观察SCAP蛋白的亚细胞定位;构建FASN基因启动子载体,转染至肝脏细胞,并分别转染pc DNA3.1-SREBP1和pc DNA3.1-SCAP作为处理,荧光素酶报告基因系统分析对FASN启动子活性的影响。结果发现克隆得到SCAP的PCR产物为3 836 bp的片段,通过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SCAP表达载体,经酶切和测序鉴定正确;将pc DNA3.1-SCAP载体转染肝脏细胞培养24 h、48 h、72 h后,Real-time PCR检测发现与对照组相比,48 h时细胞中SCAP基因m RNA的表达倍数增加了21倍(p0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SCAP呈红色,二者融合后发现SCAP定位于细胞质;启动子活性检测发现,与对照组相比,SREBP1质粒处理的细胞FASN启动子活性增加了4.1倍(p0.001),而SCAP和SREBP1共同处理细胞FASN启动子活性极显著增加了7.4倍(p0.000 1)。试验克隆构建奶牛SCAP基因表达载体,亚细胞定位SCAP蛋白主要位于肝脏细胞质中,表明SCAP可以通过结合SREBP1促进FASN基因启动子的转录。     

带绿色荧光蛋白标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白的真核表达及其生物学功能研究

目的:构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cdc25c)基因的真核表达载体pEGFP-cdc25c,并检测其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况及生物学功能。方法:采用PCR技术从实验室已有质粒中扩增人cdc25c基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测转染细胞的表达情况,荧光显微镜观察cdc25c蛋白在细胞中的定位,并利用cdc2 Tyr15位特异性抗体验证EGFP-cdc25c作为磷酸酯酶的生物学功能。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-cdc25c真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达,在荧光显微镜下,表达阳性的细胞呈绿色,并定位于细胞质;Western印迹结果表明,EGFP-cdc25c能增加cdc2 Tyr15位的磷酸化水平,起到拮抗内源性cdc25c的功能。结论:构建了带EGFP标签的人cdc25c基因真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞质;EGFP-cdc25c能够发挥显性负性作用,为深入研究cdc25c的生物学功能奠定了重要基础。     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA—MB-231细胞中的表达

目的：构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—C1—PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位。方法：采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达载体,脂质体Lip2000介导转染MDA—MB-231细胞,real—time PCR和western—blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果：酶切和测序结果证实重组质粒含有PPAIh编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布。结论：成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA—MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核。     

降低细胞内tTG活性可使细胞获得对TNF-α的抗性

 用 Northern印迹证实在 He La细胞中有 t TG的表达 ,且这种表达受 TNF-α的上调 .构建t TG反义真核表达质粒并转染 He La细胞 ,用 G41 8抗性筛选稳定表达的转染细胞 ,并用 Northern印迹和 t TG活性测定进一步分析反义 t TG的转录 .用结晶紫及 MTT法证实阳性细胞克隆获得了对 TNF- α的抗性 ,而转染表达载体 pc DNA3的细胞仍对 TNF- α敏感 .结果表明降低 t TG活性能使细胞对 TNF- α诱发的细胞凋亡敏感性降低     

荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白在BHK-21细胞亚细胞定位的影响

【目的】探究荧光蛋白标签对马疱疹病毒I型(Equine herpes virus type 1,EHV-1)gD囊膜蛋白亚细胞定位的影响。【方法】以EHV-1基因组为模板利用PCR扩增gD全基因,分别克隆至pAcGFP1-C1和p Ds Red2-N1质粒,构建p Ac-GFP-gD(GFP-gD)和p Ds-gD-Red(gD-Red)重组质粒;将GFP基因插入gD基因信号肽序列之后并克隆至PVAX-1质粒,构建PVAX-S-GFP-gD’(S-GFP-gD’)重组质粒;将Flag标签序列与gD囊膜蛋白N端序列融合后并克隆至p VAX-1表达载体,构建p VAX-Flag-gD(Flag-gD)重组质粒。将4种不同重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过激光共聚焦显微镜对不同融合蛋白gD进行亚细胞定位。【结果】成功构建4种不同的融合蛋白gD真核表达载体;在BHK-21细胞单独表达时,不同融合蛋白gD绝大部分都定位于高尔基体,极少量定位于细胞核内。【结论】不同插入位点的荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白亚细胞定位无明显影响,这对今后研究其它蛋白亚细胞定位提供参考。     

人内皮素受体A基因克隆及表达

为了建立内皮素受体拮抗剂筛选系统,克隆人ET A基因,构建真核表达载体,并实现pTag-Lite SNAP-ET A在CHOK1细胞中的瞬时表达。从人肺腺癌细胞系A549中克隆人ET A基因,连接到pTag-Lite SNAP质粒,构建表达载体pTag-Lite SNAPET A,用FuGENER HD转染试剂将表达载体pTag-Lite SNAP-ET A转染入CHO-K1细胞内,通过荧光显微镜检测融合蛋白SNAP-ET A的表达。DNA测序结果表明pTag-Lite SNAP-ET A表达载体构建成功,荧光显微镜检测结果表明人ET A在CHO-K1细胞中有效表达。     

PPARγ基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C1-PPARγ,观察小鼠PPARγ基因在MDA-MB-231细胞中的表达及定位.方法:采用克隆和亚克隆技术构建小鼠PPARγ基因真核表达栽体,脂质体Lip2000介导转染MDA-MB-231细胞,real-time PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位.结果:酶切和测序结果证实重组质粒含有PPARγ编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于胞核,胞质有弥散分布.结论:成功构建了小鼠PPARγ基因真核表达载体,该基因在MDA-MB-231细胞中成功表达,PPARγ基因主要集中表达于胞核.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.