阿尔泰蝠蛾幼虫血细胞形态学研究

本研究采用Wright-Giemsa染色方法,利用光学显微镜观察阿尔泰蝠蛾Hepialus altaicola Wang幼虫血细胞.根据鳞翅目昆虫血细胞形态特征对阿尔泰蝠蛾幼虫血细胞进行鉴定,计数并计算各类血细胞所占的比例.发现阿尔泰蝠蛾幼虫血淋巴中存在原血胞、浆血胞、粒血胞、类绛色细胞、珠血胞和囊血胞6种细胞类型,所占比例分别为3.7％,29.9％,55.4％,2.3％,5.8％和2.9％.阿尔泰蝠蛾幼虫血细胞组成及其形态与其他鳞翅目昆虫基本一致,但是与其它种属相比,同种类型的血细胞大小和占比略有不同.粒血胞和浆血胞是阿尔泰蝠蛾幼虫血淋巴中的主要类型,其中粒血胞占比最高.该研究为深入研究阿尔泰蝠蛾血细胞形态和功能提供理论依据和基础数据.     

小卷蛾斯氏线虫侵染对草地贪夜蛾幼虫天然免疫反应的影响

【目的】探讨昆虫病原线虫小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All侵染对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda幼虫天然免疫反应的影响。【方法】借助倒置显微镜观察和鉴定草地贪夜蛾幼虫的血细胞类型,并对小卷蛾斯氏线虫侵染后不同时间的草地贪夜蛾幼虫血细胞总数目进行统计;通过倒置显微镜观察草地贪夜蛾幼虫对侵入的小卷蛾斯氏线虫的包囊反应;利用倒置荧光显微镜观察小卷蛾斯氏线虫侵染后的草地贪夜蛾幼虫血细胞对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的吞噬活性;检测小卷蛾斯氏线虫侵染后的草地贪夜蛾幼虫血淋巴中酚氧化酶(phenoloxidase, PO)活性、体内抗菌肽基因相对表达水平以及血浆的抗菌活性。【结果】从草地贪夜蛾幼虫体内共发现5种不同类型的血细胞,分别为原血细胞、粒细胞、类绛色细胞、珠血细胞和浆血细胞。注射1 μL侵染期(infective juveniles, IJs)小卷蛾斯氏线虫(3 IJs/μL)后9和12 h,草地贪夜蛾幼虫的血细胞总数目显著增多。草地贪夜蛾幼虫的血细胞不能包囊活的以及冷处死的小卷蛾斯氏线虫,但可以包囊热处死的线虫。活的小卷蛾斯氏线虫会显著抑制草地贪夜蛾幼虫血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬活性,但冷处死和热处死的线虫不能。注射1 μL(3 IJs/μL)小卷蛾斯氏线虫后,草地贪夜蛾幼虫血淋巴PO活性总体呈“下降 升高 下降”变化趋势;体内抗菌肽基因Attacin-A2, Attacin-B1, Cecropin-B3, Cecropin-D, Gallerimycin, Gloverin-3以及Lebocin-2的表达水平在线虫侵染后12 h时显著上调,24 h时恢复到对照水平或低于对照水平;血淋巴抗菌活性水平在小卷蛾斯氏线虫侵染后12 h时显著升高,24 h时与对照无显著差异。【结论】小卷蛾斯氏线虫在侵入早期会抑制草地贪夜蛾幼虫的天然免疫反应来建立感染;随后草地贪夜蛾的免疫系统会被激活试图抵御小卷蛾斯氏线虫的侵染;后期随着线虫的成功定殖,草地贪夜蛾的免疫系统最终被抑制或破坏。本研究所得结果为进一步揭示线虫 草地贪夜蛾的免疫互作机理奠定了基础,也为改善昆虫病原线虫对草地贪夜蛾的防治效果提供了理论依据。     

氧化损伤是热胁迫下小金蝠蛾幼虫不能存活的重要原因

【目的】小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensis是冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis的寄主昆虫,生活于高海拔、高寒地区,低温适应性强,但在室温下（25~27℃）不能正常存活。本研究检测了热胁迫（27℃）对小金蝠蛾幼虫消化酶及抗氧化系统的影响,以期揭示小金蝠蛾室温不耐受的生理机制。【方法】小金蝠蛾8龄幼虫分两组进行处理：高温组于27℃下饲养,对照组于16℃下饲养。处理24 h后观察虫体状态,并解剖,取中肠及血淋巴。透射电镜观察中肠细胞线粒体结构,分别测定中肠总蛋白酶和糖基水解酶活性,血淋巴丙二醛（MDA）含量,以及血淋巴保护酶系中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性。【结果】两组幼虫中肠总蛋白酶及糖基水解酶活性均随反应温度（16~37℃）升高而增强。协方差分析显示,高温组幼虫酶活性极显著低于对照组（P<0.01）。然而,高温组幼虫在27℃下的酶活性与对照组幼虫在16℃下的酶活性无显著差异（P<0.05）。热胁迫下虫体血淋巴中丙二醛含量显著升高（P<0.05）,提示出现了氧化损伤。透射电镜结果显示,高温组中肠细胞线粒体肿胀,膜受损,嵴排列混乱,结构破坏。对活性氧起清除作用的3种保护酶中,仅POD活性显著升高（P<0.05）,SOD和CAT活性均无显著变化（P>0.05）。【结论】消化酶活性的变化可能不是小金蝠蛾室温不耐受的重要因素;氧化损伤是其热胁迫下不能正常存活的一个重要原因。     

Ni胁迫对斜纹夜蛾幼虫包囊反应的影响

将不同浓度Ni2+添入人工饲料中,研究连续3代取食含不同剂量Ni2+饲料的斜纹夜蛾5、6龄幼虫血细胞对凝胶珠包囊反应的影响。将新蜕皮的5龄幼虫记为0 h,每隔24 h注射凝胶珠处理幼虫,直至6龄末,注射24h后解剖虫体,观察包囊情况。结果表明,5mg/kg及以下处理浓度Ni2+的1代胁迫可提高0-120 h幼虫血细胞对凝胶珠的包囊反应,但2-3代的胁迫只增加发育初期0-72 h幼虫血细胞的包囊反应;10-20 mg/kg处理浓度Ni2+的1代胁迫仅增加0-24 h幼虫血细胞的包囊率,但可降低2-3代幼虫血细胞各发育时间的包囊率。此外,40 mg/kg Ni2+胁迫可连续降低3个世代各个发育阶段幼虫的包囊反应。饲料中Ni2+剂量、胁迫世代数以及两者的交互作用均对幼虫包囊率产生了显著影响。     

幼虫密度对草地螟血细胞数量和组成的影响

为了阐明幼虫密度对草地螟Loxostege sticticalis L.（鳞翅目： 螟蛾科）细胞免疫能力的影响, 本研究调查了在活体灰菜植株上1,5,10和20头/瓶（900 mL）4种密度条件下的其5龄幼虫血细胞种类、数量和组成。结果表明： 草地螟幼虫血淋巴中有原血细胞、浆血细胞、 颗粒血细胞、珠血细胞和类绛色血细胞等5种（类）血细胞。血细胞总数、 浆血细胞、颗粒血细胞数量随幼虫密度的增加而显著递增, 但原血细胞、珠血细胞和类绛色血细胞数量在幼虫密度间的差异不明显;各种血细胞所占血细胞总数的比例在4个密度中的排序相同, 但10和20头/瓶密度下的浆血细胞比例显著高于1头/瓶的,其余4种血细胞的比例在不同密度之间无显著差异。可见, 幼虫密度主要是通过影响草地螟幼虫浆血细胞和颗粒血细胞的数量及血细胞总数, 从而影响草地螟的细胞免疫能力。     

白蛾周氏啮小蜂毒液对美国白蛾蛹血细胞免疫的影响

【目的】明确白蛾周氏啮小蜂Chouioia cunea毒液对其寄主美国白蛾Hyphantria cunea蛹细胞免疫的影响。【方法】采用Na_2-EDTA分离美国白蛾蛹颗粒细胞,尼龙毛法分离浆血细胞,再利用细胞离体培养法,测评了白蛾周氏啮小蜂毒液对寄主美国白蛾两种血细胞包囊作用和吞噬作用的影响。【结果】美国白蛾颗粒细胞的包囊指数强于浆血细胞。白蛾周氏啮小蜂毒液对颗粒细胞和浆血细胞的包囊指数均有明显的抑制作用,毒液浓度越大,抑制作用越强,两种血细胞的包囊作用均呈先增长后降低的趋势。在所有浓度毒液处理下,颗粒细胞的包囊指数在12 h时最强。未经小蜂毒液处理的浆血细胞包囊指数在15 h时达到最强,但经浓度为0.01~0.03 VRE/μL的毒液处理后浆血细胞的包囊指数在12 h时达到最强,而经浓度为0.04~0.10 VRE/μL的毒液处理后包囊指数在9 h时最强。白蛾周氏啮小蜂毒液对美国白蛾蛹颗粒细胞的吞噬作用强于浆血细胞。毒液对两种血细胞的吞噬能力均有明显的抑制作用,但毒液处理对浆血细胞的吞噬作用影响较小。【结论】白蛾周氏啮小蜂毒液可以抑制美国白蛾蛹颗粒细胞和浆血细胞的包囊作用和吞噬作用,且随着毒液浓度的增加,两种血细胞的免疫作用显著下降。     

亚洲玉米螟幼虫血细胞的包囊行为

根据光镜和电镜观察结果,将亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫血细胞分为粒细胞、浆细胞、类绛色细胞、原血细胞和球形血细胞五类。调查了幼虫的血细胞总数(THC)和各类血细胞数量(DHC)的变化情况。从三龄末期到五龄第五天期间,幼虫的THC在蜕皮前后会下降,蜕皮后约12h降到最低点,然后又慢慢回升。在五龄幼虫前5d期间,浆细胞在前第三天呈增加趋势,之后开始下降,而粒细胞呈相反趋势。浆细胞和粒细胞具有附着延展性,它们可以附着在载玻片表面,但延展能力不同。血细胞可以迅速黏附在外源物如葡聚糖凝胶珠表面形成包囊,部分包囊会发生黑化现象。体外培养条件下,血细胞也可以形成包囊,其结构与体内形成的包囊差异不大。     

转cry1Ab基因水稻对二化螟幼虫血细胞的影响

研究了转cry1Ab基因水稻“克螟稻1号”对二化螟Chilo suppressalis幼虫细胞免疫系统的影响。结果表明,转cry1Ab基因水稻对二化螟幼虫的血细胞影响明显,取食转cry1Ab基因水稻后,二化螟幼虫各类血细胞都明显低于取食非转基因水稻“秀水11”的对照组（原血细胞和囊血细胞在取食初期例外）,随取食时间延长,各类血细胞数量及血细胞总数均呈递减的趋势。从各类血细胞所占血细胞总数的百分比来看,原血细胞在取食36 h后锐减,而浆血细胞和粒血细胞则比例增加,其余珠血细胞、囊血细胞的变化不明显。另外,血细胞还出现空泡化、肿胀等病态变化,致使血细胞快速破裂。由此推测转cry1Ab基因水稻自身表达的毒蛋白能严重干扰靶标昆虫二化螟幼虫的细胞免疫系统。     

黑翅痂蝗血细胞形态学的研究

【目的】蝗虫血细胞的研究以及不同血细胞类型间的演化关系,是蝗虫细胞免疫学的依据,也是防蝗治蝗的重要依据。【方法】本研究通过Wright-Giemsa对黑翅痂蝗Bryodema nigroptera Zheng血细胞进行了混合染色,并使用光学显微镜进行了观察。【结果】发现黑翅痂蝗血细胞包括原血胞、浆血胞、粒血胞、类绛色血细胞、囊血胞、脂血胞、蠕形细胞和巨核血细胞8种类型。【结论】在成虫体内,原血胞占细胞总数的1%,浆血胞占32.2%,粒血胞占57.3%,类绛色血细胞占1%,囊血胞占6%,脂血胞占1%,蠕形细胞占1%,巨核细胞占细胞总数的0.5%,粒血胞数量最多,巨核细胞最少。     

一种体外分析亚洲玉米螟幼虫血细胞包囊的改进方法

包囊反应是昆虫清除侵入体内的外源物如病原物和寄生生物的一种非常重要的细胞免疫反应。由于受到不便于观察、操作复杂等问题的限制,很多包囊分析实验无法或难于在昆虫体内完成。体外包囊方法在一定程度上解决了这些问题。目前常用的体外包囊是在96孔板中加入昆虫血细胞和外源物,如凝胶珠进行培养观察,但这种方法存在着一些明显的缺陷。本文以亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫血细胞为研究对象,使用0.2mL的离心管(Eppendorf tube)代替96孔板,并将其固定在匀速旋转的载体上培养,极大程度的模拟了反应物在昆虫体内的状态。结果表明,改进方法后昆虫血细胞的体外包囊效果得到明显提高,且血细胞的状态也得到明显改善;而添加抗凝剂会减弱血细胞对外源物的包囊能力。     

小菜蛾整合素integrin β1基因的克隆及其功能分析

整合素(Integrin)是一种由α和β亚基组成的跨膜异二聚体蛋白,在昆虫血细胞对外物的包囊过程中起着重要的作用。为阐明integrinβ1参与小菜蛾Plutella xylostella体内细胞免疫中的功能,本研究利用RT-PCR结合RACE技术克隆了小菜蛾integrinβ1基因的cDNA全长序列,命名为PxIntβ1(Gen Bank登录号GQ178290)。小菜蛾PxIntβ1的cDNA全长序列为2 832 bp,开放阅读框为2 487 bp,编码828个氨基酸,成熟的氨基酸序列中有一个跨膜区和一个integrin亚基。系统进化树显示小菜蛾PxIntβ1与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis整合素的同源性最高,两者同源性达到78%。利用半定量RT-PCR技术检测PxIntβ1基因在小菜蛾不同发育历期(卵、1-4龄幼虫、蛹、成虫)、不同组织(血细胞、体壁、脂肪体、中肠、马氏管)和细菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液)诱导下的表达模式。半定量结果表明小菜蛾PxIntβ1基因在小菜蛾整个发育历期除了卵之外都有表达,4龄幼虫转录水平最高,在血细胞中特异性的高表达,混合细菌诱导2-48 h后,PxIntβ1基因在小菜蛾诱导后24 h达到诱导表达高峰。为了进一步获得重组蛋白PxIntβ1,本研究构建了原核表达质粒pET-32a-PxIntβ1,融合蛋白在大肠杆菌Eschericha coli BL21中获得高效表达,Ni-NTA一步纯化了融合蛋白,并免疫新西兰大白兔,获得了多克隆抗体anti-PxIntβ1。SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果表明,His抗体和多克隆抗体anti-PxIntβ1能特异性识别融合蛋白PxIntβ1;进一步利用显微镜观察了小菜蛾血细胞对凝胶珠Sephadex-A25的包囊情况,结果表明抗血清anti-PxIntβ1处理过的小菜蛾血细胞对Sephadex-A25凝胶珠的包囊作用受到明显抑制,重组蛋白PxIntβ1可以提高小菜蛾血细胞对Sephadex-A25凝胶珠的包囊作用;以上研究结果表明小菜蛾PxIntβ1在小菜蛾细胞免疫中起着重要的作用。     

重金属Cd2+对棕尾别麻蝇血细胞数量、包囊作用和形态结构的影响

为了揭示重金属对昆虫细胞免疫的影响及其机理,本文采用血细胞计数、台盼蓝染色、延展与包囊率测定, 以及显微与超微结构观察等方法,以经重金属Cd²⁺（浓度为150 μg/g）处理的棕尾别麻蝇Boettcherisca peregrina及其对照为研究对象,分别测定了处理组与对照组血细胞的数量与存活率、延展与包囊率,观察其形态结构,并比较了两组间的差异。结果表明： 棕尾别麻蝇初产幼虫经连续喂饲含Cd²⁺的饲料24,48,72和96 h后,与对照相比其血细胞总数和存活率显著下降,而血细胞的延展率和包囊作用的显著下降则分别出现于取食72和48 h之内,此后则下降不显著;由Cd²⁺处理幼虫发育形成蛹的血细胞包囊作用也显著低于对照。形态结构观察结果表明,Cd²⁺处理对幼虫的原血细胞、浆血细胞、颗粒血细胞和类绛色血细胞的显微形态影响不大,但可导致部分浆血细胞不能产生伪足;但均能导致各类血细胞的超微结构发生不同程度的变化,其中主要变化包括：细胞膜受损或破裂,染色质呈现凝聚, 线粒体和内质网等细胞器明显减少,以及胞质内出现空囊泡。结果说明重金属Cd²⁺对棕尾别麻蝇的血细胞可具有毒害作用。     

家蝇幼虫血细胞类型及免疫功能的初步研究

目的用不同方法观察家蝇3龄幼虫血细胞的形态,并对血细胞进行分类和免疫功能研究,为昆虫血细胞形态、分类及免疫研究提供实验依据。方法 (1)应用姬氏染色结合相差显微镜及荧光染色方法观察家蝇3龄幼虫血细胞形态,并对家蝇3龄幼虫血细胞进行分类;(2)观察家蝇3龄幼虫感染大肠杆菌后不同时间血细胞总数(THC)、各类血细胞数量(DHC)及形态的变化;(3)应用倒置显微镜观察家蝇3龄幼虫离体血细胞感染大肠杆菌后的形态变化;(4)采用酶细胞化学技术测定感染前后家蝇3龄幼虫血细胞中ACP、POD活性的变化。结果 (1)家蝇3龄幼虫血细胞可分为原血胞、浆血胞、粒血胞、珠血胞、类绛血胞5类,其中浆血胞又分为大核浆血胞和小核浆血胞两种;(2)感染后各时间组血细胞总数、浆血胞和粒血胞数量均显著升高,且浆血胞和粒血胞聚集成堆,出现细胞变形、空泡等形态变化;感染后16h、24h组的珠血胞数显著升高;原血胞和类绛血胞数量和形态无明显变化;(3)家蝇幼虫离体血细胞感染大肠杆菌后粒血胞周围见大量细菌聚集,浆血胞、粒血胞聚集成团将细菌包裹形成包囊,未见原血胞、珠血胞、类绛血胞形态的变化;(4)感染后浆血胞和粒血胞中ACP、POD的活性增强,感染前后原血胞、珠血胞、类绛血胞中均未见ACP、POD的阳性反应物。结论通过3种方法能很好地将家蝇3龄幼虫血细胞分为5类,其中浆血胞和粒血胞是家蝇幼虫参与免疫反应的主要细胞类型,珠血胞不参与感染后的早期细胞免疫反应。     

阿尔泰蝠蛾(鳞翅目:蝙蝠蛾科)幼虫低温胁迫转录组分析

[目的]本研究旨在通过转录组测序技术分析低温胁迫引起的阿尔泰蝠蛾Hepialus altaicola Wang幼虫基因转录差异及上调表达基因的主要功能类群和参与的主要代谢通路.[方法]采用Illumina HiSeq TM 2500测序平台对阿尔泰蝠蛾幼虫进行转录组测序、组装,利用Blast软件进行数据库比对和基因功能注释,用DEGSeq R软件包分析4℃低温处理与室内适温饲养试虫的差异表达基因,并对上调表达基因进行GO和KEGG代谢途径富集分析.[结果]经序列拼接后共获得100300个unigenes,总长度81600309 bp,平均长度813 bp,N50长度1719 bp.与7大数据库同源比对,共获得34691(34.59％)条unigenes.低温胁迫转录组分析得到11569个差异表达基因(DEGs),7158条基因上调,4411条基因下调.富集到47个GO类群,217个KEGG途径.其中代谢过程、催化、结合活性类群占有重要比例,核糖体、碳代谢、剪接体等途径显著富集.另外,热激蛋白、昆虫表皮蛋白、海藻糖酶、超氧化物歧化酶等非生物胁迫相关基因显著上调表达.[结论]阿尔泰蝠蛾幼虫低温胁迫转录组分析揭示,代谢过程、细胞过程、生物调节、对刺激的反应等生物学过程相关基因和部分非生物胁迫响应基因显著上调表达,提示蝠蛾幼虫可能从抗氧化防御、分子伴侣、体温调节和维持细胞的渗透平衡等多方面应对低温胁迫.     

阿尔泰蝠蛾(鳞翅目:蝙蝠蛾科)幼虫低温胁迫转录组分析

[目的]本研究旨在通过转录组测序技术分析低温胁迫引起的阿尔泰蝠蛾Hepialus altaicola Wang幼虫基因转录差异及上调表达基因的主要功能类群和参与的主要代谢通路.[方法]采用Illumina HiSeq TM 2500测序平台对阿尔泰蝠蛾幼虫进行转录组测序、组装,利用Blast软件进行数据库比对和基因功能注释,用DEGSeq R软件包分析4℃低温处理与室内适温饲养试虫的差异表达基因,并对上调表达基因进行GO和KEGG代谢途径富集分析.[结果]经序列拼接后共获得100300个unigenes,总长度81600309 bp,平均长度813 bp,N50长度1719 bp.与7大数据库同源比对,共获得34691(34.59％)条unigenes.低温胁迫转录组分析得到11569个差异表达基因(DEGs),7158条基因上调,4411条基因下调.富集到47个GO类群,217个KEGG途径.其中代谢过程、催化、结合活性类群占有重要比例,核糖体、碳代谢、剪接体等途径显著富集.另外,热激蛋白、昆虫表皮蛋白、海藻糖酶、超氧化物歧化酶等非生物胁迫相关基因显著上调表达.[结论]阿尔泰蝠蛾幼虫低温胁迫转录组分析揭示,代谢过程、细胞过程、生物调节、对刺激的反应等生物学过程相关基因和部分非生物胁迫响应基因显著上调表达,提示蝠蛾幼虫可能从抗氧化防御、分子伴侣、体温调节和维持细胞的渗透平衡等多方面应对低温胁迫.     

大口黑鲈外周血细胞显微结构、细胞化学特征及吞噬作用的研究

通过对大口黑鲈外周血细胞的显微结构及细胞化学染色特征和吞噬作用的研究,为大口黑鲈免疫学研究积累资料。Wright's染色表明:大口黑鲈外周血细胞分为红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血栓细胞,其中粒细胞又分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。外周血中成熟红细胞最多,占血细胞总数的98.12%,其次为淋巴细胞和血栓细胞,占白细胞中的比例分别为60.92%和22.99%;单核细胞最大,大小为(9.89±0.70)μm×(8.72±0.68)μm;小淋巴细胞最小,大小为(3.88±0.46)μm×(3.48±0.40)μm。大口黑鲈外周血细胞的免疫相关酶ACP、AKP、PO、POX及细胞成分PAS反应、SBB染色的结果表明,所有红细胞的细胞化学染色均呈阴性,不同白细胞的细胞化学染色特征存在差异。其中所有白细胞的AKP、POX染色均呈阴性,PAS反应均呈阳性,除Ⅱ型粒细胞外所有白细胞的PO、ACP染色均呈阳性,除单核细胞外所有白细胞的SBB染色均呈阳性。大口黑鲈外周血细胞吞噬酵母菌的实验表明,红细胞能够吞噬酵母菌,其吞噬率为(15.70±1.07)%,也观察到部分白细胞吞噬酵母的现象。PO和ACP及脂类和糖类可能是大口黑鲈外周血细胞吞噬作用的重要酶类和能量来源。     

家蝇Mdsirt1基因在细菌、高温和重金属胁迫下的表达分析

【目的】探究家蝇Musca domestica sirt1基因(Mdsirt1)在各种胁迫条件下的表达模式。【方法】以家蝇2龄幼虫cDNA为模板,PCR扩增Mdsirt1基因序列并进行生物信息学分析;实时定量PCR(qRT-PCR)检测Mdsirt1在家蝇不同发育阶段(卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹和成虫)的表达变化,2龄幼虫不同组织(表皮、肠道、脂肪体和血细胞)中的表达分布,以及胁迫条件(细菌刺激、热激及CdCl_2刺激)下的转录水平变化;通过RNAi干扰Mdsirt1基因表达,观察敲低Mdsirt1表达后家蝇幼虫抗病能力变化,并检测机体氧化应激水平。【结果】家蝇Mdsirt1基因编码蛋白含有SIR2结构域,与厩螫蝇Stomoxys calcitrans SIR2氨基酸序列一致性为66%。qRT-PCR结果显示,Mdsirt1基因主要在家蝇蛹期表达,在家蝇2龄幼虫脂肪体中表达量较高。家蝇幼虫Mdsirt1分别在大肠杆菌Escherichia coli刺激3 h,金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus刺激6 h,42℃热激30min以及30 mmol/L CdCl_2刺激48 h时表达量达到最高峰。敲低Mdsirt1表达的家蝇幼虫受到细菌感染(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1∶1混合感染)后存活率较对照组显著降低1.47倍,且敲低Mdsirt1后机体处于氧化应激状态,活性氧自由基水平和丙二醛含量较对照组分别升高1.58和1.59倍。【结论】Mdsirt1参与家蝇幼虫的抗菌免疫应答和抗逆反应。     

交配和温度对草地贪夜蛾性信息素通讯的影响

【目的】明确交配和温度对草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda性信息素通讯的影响,为田间草地贪夜蛾的性信息素防治提供参考。【方法】采用溶剂浸提法提取草地贪夜蛾雌蛾性信息素腺体中的化学组分;利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对提取物中的组分进行化学鉴定;利用气相色谱（GC）技术分析雌蛾腺体中各组分的含量;利用触角电位（EAG）技术测定雄蛾对腺体各组分及性信息素类似物的电生理反应。在不同温度（20-35）℃下饲养草地贪夜蛾,以研究温度对其性信息素通讯的影响。【结果】GC-MS分析发现,草地贪夜蛾雌蛾腺体内含有Z7-12:Ac等7种组分。交配实验表明,雌蛾在1个暗期内只交配1次,在羽化后7 d内可交配多次,其中交配2次及以上的占44%（单对放置）和67%(30对放置)。交配显著抑制雌蛾在次日暗期（交配后第1个暗期）的求偶活动,但在交配后第2个暗期基本恢复正常;在交配后第1个暗期,雌蛾腺体中主要组分Z9-14:Ac的含量和比例较对照雌蛾显著升高,其他组分无显著变化。在20-35℃的饲养温度范围内,雌蛾腺体内16:Ac的含量在35℃时最高,在20℃时未能检测出;各测试温度下Z11-16:Ac的含量相差不显著;其余5种组分均在25℃时最高;主要活性组分Z7-12:Ac和Z9-14:Ac在35℃时显著降低。饲养温度对腺体内各组分的相对比例也有较大影响,12:Ac、Z11-14:Ac、Z11-16:Ac和16:Ac所占比例均在30-35℃时较高,而Z9-14:Ac则在20-25℃时较高。不同饲养温度所得雄蛾对腺体主要组分的触角电位反应无显著差异。【结论】交配显著抑制草地贪夜蛾雌蛾在次日的求偶行为;25℃饲养条件最适宜雌蛾腺体内性信息素等组分的合成。     

小菜蛾普通气味受体基因PxylOR9的鉴定及功能研究

【目的】克隆小菜蛾Plutella xylostella一普通气味受体基因,明确其在不同组织中的表达分布,并鉴定其功能,为了解小菜蛾对寄主植物的识别机制提供理论基础。【方法】在小菜蛾成虫触角转录组测序和分析的基础上,通过PCR技术克隆得到一气味受体基因的全长序列,利用半定量RT-PCR研究其在雌雄蛾不同组织中的表达,并通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳技术测试该受体对59种植物挥发物刺激的反应。【结果】在前期研究中,通过转录组测序和生物信息学分析,预测获得了多条小菜蛾气味受体基因序列。本研究中,我们克隆得到了其中一小菜蛾气味受体基因Pxyl OR9的c DNA全长序列(Gen Bank登录号:KP757898)。Pxyl OR9包括6个跨膜结构域,N末端位于胞内,符合昆虫气味受体的典型特征。与其他鳞翅目昆虫气味受体构建的进化树分析结果显示,Pxyl OR9与性信息素受体具有明显的分离,并与普通气味受体聚集在一起。半定量RT-PCR结果显示,Pxyl OR9仅在雌雄触角中表达且无雌雄差异。双电极电压钳记录结果显示,在测试的植物挥发物中Pxyl OR9只对植物挥发物!-紫罗兰酮的刺激具有反应。【结论】本研究从小菜蛾中克隆得到Pxyl OR9的全长序列,其编码产物具有气味受体的典型特征并且属于普通气味受体。该基因在仅在小菜蛾成虫触角中高表达。体外功能研究证明Pxyl OR9对植物挥发物!-紫罗兰酮具有特异反应,推测其参与了小菜蛾对植物的识别。     

禽流感病毒M2e、NP多表位嵌合肽抗原的构建及免疫原性

摘要: 【目的】为了克服传统禽流感疫苗各亚型之间无交叉保护的缺陷,研制抗禽流感通用型疫苗。【方法】 以禽流感病毒M2e、NP表位为基础串联T细胞表位构建4个原核表达载体: pET-3M2e、pET-3M2e-NP1,2-Fc、pET-3M2e-NP1,2、pET-TCE-3M2e-NP1,2。纯化重组蛋白并与弗氏佐剂混合制成疫苗,胸部肌肉注射免疫20日龄非免鸡(150μg/只),4个融合蛋白分为四组,每组十只。ELISA方法检测血清中M2e抗体水平;在MDCK细胞上检测血清与H9N2亚型禽流感病毒的结合能力,在鸡胚上检测其中和能力;以流式细胞仪测定CD4+、CD8+T淋巴细胞的变化。【结果】研究发现,各免疫组均能检测到高水平的ELISA抗体,免疫荧光显示抗血清均能跟病毒特异性结合,中和试验表明抗血清不能中和病毒但能抑制病毒的复制。流式细胞仪检测显示外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞所占比例在免疫后均有明显升高(P<0.05),TCE-3M2e-NP1, 2组CD4+、CD8+T淋巴细胞所占比例分别达到47.23%和36.77%,具有细胞免疫的特征。【结论】构建的嵌合肽抗原具有较好的免疫原性,能刺激机体产生体液和细胞免疫,为进一步研制抗禽流感通用型疫苗做出有益的探索。