绿盲蝽核受体基因AlE75D的克隆和性质分析

【目的】克隆绿盲蝽Apolygus lucorum核受体基因E75D全长,明确其表达谱,并获得该基因的重组蛋白及制备其单克隆抗体。【方法】利用RACE法克隆绿盲蝽核受体基因Al E75D全长;qRTPCR法分析绿盲蝽不同日龄成虫(1-16 d)及7日龄雌成虫6种组织(脂肪体、飞行肌、卵巢、马氏管、中肠和表皮)中该基因的mRNA相对表达水平;利用NdeⅠ和XbaⅠ双酶切含有目的基因的p MD18-T载体后进行亚克隆,再利用IPTG诱导的重组质粒进行特异性表达重组蛋白,通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析纯化靶蛋白;最后通过小鼠免疫、细胞融合及腹水制备重组蛋白的单克隆抗体,Western blot验证该抗体的特异性。【结果】从绿盲蝽中克隆获得蜕皮激素核受体基因Al E75D(Gen Bank登录号:KX912700),其开放阅读框长1 911 bp,编码636个氨基酸,预测分子量为75.68 k D;该基因编码蛋白具有E75D的典型特征,由A/B域(23 aa)、D域(85 aa)、E域(190aa)和F域(338 aa)组成,但缺失C域;绿盲蝽Al E75D的氨基酸序列与半翅目蝽科的豆荚草盲蝽Lygus hesperus的E75D序列一致性最高(为98%)。Al E75D在整个绿盲蝽成虫期均有表达,在7日龄雌成虫中达到峰值;此外,Al E75D在雌成虫6个供试组织中也均有表达,并在脂肪体及卵巢中高表达。双酶切后的重组克隆载体可成功亚克隆到p Czn1载体上,IPTG可成功诱导p Czn1-Al E75D重组质粒特异性表达一个约75 k D的蛋白。用Ni-NTA琼脂糖树脂凝胶纯化重组蛋白,以纯化的重组蛋白为抗原,获得了一株能稳定传代并分泌抗Al E75D蛋白单克隆抗体的细胞株,该单克隆抗体可与绿盲蝽总蛋白及Al E75D重组蛋白特异性结合。【结论】Al E75D在绿盲蝽体内的表达谱表现出发育阶段特异性和组织特异性;本研究获得的其重组蛋白的单克隆抗体具有高特异性。结果为进一步在蛋白水平上分析该基因的功能奠定基础。     

琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析

【目的】本研究旨在克隆琥珀蚕Antheraea assama丝腺转录因子基因AaSGF-1,分析其序列特征及表达模式并制备多克隆抗体,为探讨该基因的生理功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从琥珀蚕丝腺中克隆AaSGF-1的cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄第4天幼虫不同组织(头、中肠、脂肪体、丝腺、血液、表皮)中的表达模式;构建原核表达质粒载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达AaSGF-1,利用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔子,获得高效的抗体。利用免疫荧光技术检测AaSGF-1在琥珀蚕蚁蚕丝腺和表皮及4龄幼虫丝腺中的表达情况。【结果】克隆了琥珀蚕AaSGF-1的cDNA序列(GenBank登录号： MK889510.1),开放阅读框(ORF)序列长1 050 bp,编码349个氨基酸残基,预测蛋白分子质量为38.8 kD,理论等电点(pI)为8.74。qPCR检测结果显示AaSGF-1在琥珀蚕5龄幼虫丝腺组织尤其是后部丝腺中高量表达,而在其他组织中几乎不表达。免疫荧光结果表明AaSGF-1在蚁蚕及4龄幼虫的丝腺中表达。【结论】本研究原核表达了琥珀蚕AaSGF-1,制备了多克隆抗体,证实了AaSGF-1在琥珀蚕幼虫的丝腺中高表达,为进一步研究该基因在琥珀蚕丝腺发育及丝蛋白合成中的作用奠定了基础。     

绿盲蝽磷脂酶C(AlPLC)的表达、纯化及酶学性质

【目的】本文在前期获得绿盲蝽Apolygus lucorum磷脂酶C基因(Al PLC)的基础上,明晰Al PLC基因在绿盲蝽不同日龄若虫中的表达特征,阐明Al PLC重组蛋白的酶学性质。【方法】qRTPCR法分析1-13日龄绿盲蝽若虫Al PLC的表达量;构建含有Al PLC基因的原核表达载体p Czn1-Al PLC;进一步将该表达载体经IPTG诱导表达和蛋白纯化,获得具有磷脂酶活性的重组蛋白;以pNPPC(P-硝基苯基磷酸胆碱)为底物测定不同温度和不同p H下的重组Al PLC蛋白酶活性,最终确定了其酶活性的最佳p H和最适温度。【结果】Al PLC mRNA在绿盲蝽测定的若虫期持续表达,在4,8,12以及13日龄若虫中表达量相对较高。重组蛋白Al PLC可在大肠杆菌Escherichia coli中表达一个约79 k D的蛋白,12%SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体形式存在;经过变性,复性获得具有磷脂酶活性的纯化蛋白。在蛋白浓度为0.25 mg/m L条件下,该酶最适温度为57℃(179.54±3.96 nmol/μg·min),最适p H为8.5(374.99±2.84 nmol/μg·min)。【结论】结果表明Al PLC在绿盲蝽若虫中表达具有特异的发育历期特性,获得的重组蛋白在较高温度和碱性环境下有较高磷脂酶活性。本研究结果为后续在蛋白水平上解析Al PLC的功能奠定基础。     

飞蝗细胞色素P450基因LmCYP6FD3的表达及其在杀虫剂解毒中的作用

【目的】研究飞蝗Locusta migratoria细胞色素P450基因的分子特性和生物学功能。【方法】搜索飞蝗转录组数据库,获得细胞色素P450基因cDNA序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA全长序列。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定其在飞蝗5龄若虫不同组织(胃盲囊、前肠、中肠、后肠、体壁、精巢、卵巢、肌肉、血淋巴、脂肪体和马氏管)中及不同发育阶段(卵、1-5龄若虫及成虫)的表达水平。采用RNA干扰(RNAi)技术沉默飞蝗2龄若虫细胞色素P450基因,检测基因的沉默效率,并研究该基因干扰后,2龄若虫对杀虫剂马拉硫磷、西维因和溴氰菊酯3种杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列(Gen Bank登录号:KT316378),将其命名为LmCYP6FD3,其核苷酸序列全长为1 563 bp,编码521个氨基酸。研究发现该基因在飞蝗5龄若虫马氏管中高表达,其次是后肠和脂肪体中,在其他组织中的表达量相对较低;对LmCYP6FD3在飞蝗不同发育阶段的表达进行检测,发现该基因在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫期表达量较高。RNA干扰结合杀虫剂生物测定结果表明,LmCYP6FD3在RNA干扰24 h时的沉默效率最高;2龄若虫点滴接触西维因,RNAi处理组(dsLmCYP6FD3注射组)与对照组(ds GFP注射组)相比,死亡率提高了32%。【结论】克隆获得飞蝗LmCYP6FD3的cDNA全长序列,该基因在飞蝗马氏管中高表达,并可能参与西维因在飞蝗体内的解毒代谢。     

黑肩绿盲蝽耐饥饿能力的研究

【目的】为早期释放黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis提供理论依据,研究了黑肩绿盲蝽不同虫态耐受饥饿及低温的能力。【方法】室内条件下,比较了稻苗+水、无苗有水和无苗无水三种食物条件下黑肩绿盲蝽耐饥力大小。【结果】适温(26℃)下,黑肩绿盲蝽3龄若虫、5龄若虫和成虫在稻苗+水的存活时间显著高于无苗有水,无苗有水时的存活时间又显著高于无苗无水,表明稻苗对于黑肩绿盲蝽有营养作用,取食稻苗有助于提高黑肩绿盲蝽的耐饥力。黑肩绿盲蝽成虫耐饥力最强,3龄若虫和5龄若虫接近,有苗有水时,3龄若虫、5龄若虫和成虫的平均存活时间分别为2.10、2.22和4.25 d。在低温(15℃)下,水稻苗对黑肩绿盲蝽成虫的存活不利,有苗有水时雌雄成虫的存活时间均低于无苗有水处理,其中雌成虫两处理间的差异显著(P=0.001)。【结论】黑肩绿盲蝽对饥饿和低温有较强的耐受性,以成虫最强,水稻生长前期田间释放时以成虫为宜。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

摘要: 【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号: MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

绿盲蝽毒死蜱抗性和敏感品系乙酰胆碱酯酶-2基因的克隆、序列分析及表达水平

【目的】为了明确绿盲蝽Apolygus lucorum乙酰胆碱酯酶-2(acetylcholinesterase-2,ACh E2)与毒死蜱抗性的关系。【方法】本研究利用RACE技术获得了绿盲蝽ACh E2基因(Al-ace2)的全长序列,并检测了Al-ace2在绿盲蝽毒死蜱抗性品系(BZ-R)及敏感品系(SLF和BZ)中的氨基酸序列多态性及mRNA相对表达量。【结果】Al-ace2开放阅读框长1 935 bp,编码644个氨基酸残基;推导的氨基酸序列含有ACh E的典型结构,如催化三联体、氧阴离子洞、胆碱结合位点及围绕活性位点丝氨酸的保守结构域FGESAG。与两个敏感品系(SLF和BZ)相比,绿盲蝽毒死蜱抗性品系BZ-R Al-ace2基因中存在T552M氨基酸替换,发生频率为5%,但此位点氨基酸并不保守,也不靠近活性位点,推测其与抗性无关。在绿盲蝽SLF,BZ和BZ-R品系中,Al-ace1表达量均约为Al-ace2的3倍,且Al-ace2转录水平在3个品系间无显著差异。【结论】结果说明,在绿盲蝽体内ACh E2是次要表达的乙酰胆碱酯酶,该ACh E2可能与绿盲蝽BZ-R品系对毒死蜱的抗性无关。     

大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因的克隆与表达分析

【目的】储存蛋白是昆虫发育、变态和生殖过程中氨基酸的主要来源,Hexamerin是储存蛋白家族重要成员,在昆虫的生长发育中起着重要作用。为了研究hexamerin基因(SpbHex)在大豆食心虫Leguminivora glycinivorella Matsumurav生长发育过程中的作用,对大豆食心虫SpbHex基因进行克隆与表达分析。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆SpbHex的cDNA全长序列,并通过qPCR研究其在不同发育阶段和幼虫不同组织的表达情况。【结果】SpbHex基因cDNA序列全长2 161 bp,其中开放阅读框2 112 bp,编码703个氨基酸。蛋白预测分子量84.15 ku。hexamerin基因在大豆食心虫不同发育阶段和不同组织中均有表达。在不同生长发育阶段中4龄幼虫的表达量较高,1龄和成虫的表达量较低;在不同组织中脂肪体的表达量较高,表皮中的表达量最低。【结论】本研究克隆了大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因,并对其在大豆食心虫中表达模式进行分析,为进一步明确hexamerin基因在大豆食心虫生长发育中的作用奠定基础。     

绿盲蝽气味受体基因AlucOR40的克隆及功能研究

【目的】从绿盲蝽Apolygus lucorum触角中克隆气味受体基因Aluc OR40,研究该气味受体基因在绿盲蝽不同组织中的表达水平,然后对该基因的功能进行研究,为理解绿盲蝽的嗅觉识别机制提供理论基础。【方法】在绿盲蝽成虫触角转录组测序与分析的基础上,通过PCR技术克隆得到气味受体基因Aluc OR40的全长序列。用半定量RT-PCR研究该基因在雌雄虫不同组织中的表达水平。然后通过爪蟾卵母细胞体外表达该基因,并结合双电极电压钳检测了该气味受体对60种气味分子包括绿盲蝽性信息素组分和植物挥发物的反应。然后,利用触角电位技术测定羽化后3 d的绿盲蝽成虫对Aluc OR40的气味配体的触角电位反应。【结果】克隆了Aluc OR40(Gen Bank登录号:KU886190)。Aluc OR40编码398个氨基酸,蛋白具有7个跨膜结构域,N末端位于胞内,C端位于细胞外,符合昆虫气味受体的典型特征。半定量RT-PCR的结果显示,Aluc OR40在触角中特异表达,且在雄虫触角中的表达水平高于雌虫。双电极电压钳记录结果显示,Aluc OR40只对反-2-己烯醇一种气味分子具有特异反应。EAG实验结果表明,羽化后3 d的绿盲蝽雌雄虫都对反-2-己烯醇有反应,且雄虫触角的EAG反应显著高于雌虫。【结论】结果提示Aluc OR40参与了绿盲蝽对反-2-己烯醇的识别过程,推测其在绿盲蝽交配过程中雄虫对雌虫的识别中发挥作用。     

褐飞虱自噬相关基因NlATG13的表达与功能分析

【目的】自噬参与多种细胞生理过程,自噬相关蛋白ATG13是ATG1/13复合物的组成部分, 在启动自噬中发挥着重要作用。本研究旨在分析ATG13在褐飞虱Nilaparvata lugens中发挥的功能,评估其作为害虫防治靶标的潜力。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用RACE克隆褐飞虱NlATG13的cDNA全长序列;应用生物信息学技术分析NlATG13的核苷酸和氨基酸序列特征。利用RT-qPCR检测其在褐飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫和雌雄成虫)和不同组织(5龄若虫头、胸、中肠和脂肪体以及刚羽化雌成虫的卵巢)中的表达模式。通过显微注射dsNlATG13至3龄若虫进行RNAi敲减NlATG13的表达,探究其对褐飞虱生存和中肠细胞自噬的影响;利用RT-qPCR检测RNAi 4 d时3龄若虫中糖原合成与代谢通路相关基因NlGSK3, NlGS和NlGP的表达量。【结果】克隆得到NlATG13的cDNA全长序列(GenBank登录号: MF805752),其开放阅读框长1 203 bp,编码一个含400个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号: AWW05678.1)。系统发育分析表明,在纳入分析的物种中,NlATG13蛋白与半翅目温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的ATG13蛋白进化关系较为接近。发育表达谱结果表明NlATG13在褐飞虱3和5龄若虫中的表达量显著高于在1-2龄若虫、雌成虫和雄成虫中的; 组织表达谱结果表明NlATG13在5龄若虫头部和脂肪体中的相对表达量较高,在胸部的表达量最低。RNAi结果显示,与dsGFP对照组相比dsNlATG13处理组中褐飞虱中肠细胞中存在明显的糖原颗粒积累,NlGS, NlGSK3和NlGP的表达量均无显著变化,组织ATP含量显著降低;褐飞虱的存活率显著降低,处理第10天时褐飞虱存活率下降到41.4%,而dsGFP对照组的存活率保持在85.6%的较高水平。【结论】 RNA干扰NlATG13基因对褐飞虱的生存和中肠细胞自噬具有显著的抑制效果,NlATG13基因具有作为褐飞虱防治靶标的潜力。     

中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶1基因的分子特性及功能

【目的】通过研究中华稻蝗Oxya chinensis几丁质脱乙酰基酶1 (chitin deacetylase 1, CDA1)基因的分子特性和生物学功能, 为新型农药靶标筛选提供理论基础。【方法】在中华稻蝗转录组数据库搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因片段, 用生物信息学方法对其进行同源比对分析并作聚类关系图; 利用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends, RACE）获得该基因cDNA全长序列; 通过Real-time quantitative PCR(qPCR)方法检测OcCDA1在5龄若虫不同组织部位和不同发育时期的表达情况, 并采用RNAi技术研究OcCDA1在飞蝗生长发育中的功能。【结果】获得中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶1基因全长cDNA,命名为OcCDA1（GenBank登录号：KP271171）。OcCDA1在前肠、体壁、后肠和脂肪体组织中高表达, 在5龄第1天表达量显著高于以后几天。RNAi结果显示, 注射该基因的dsRNA后, OcCDA1基因的表达量降低了93.3%。OcCDA1基因沉默后虫体出现进食减少、发育迟缓现象, 总死亡率达到95.2%,其中38.1%的试虫在蜕皮前死亡, 57.1%出现因蜕皮困难而死亡的表型。【结论】OcCDA1在中华稻蝗的发育中起着重要作用, 该基因沉默引起虫体进食减少和蜕皮异常从而导致死亡。     

麦红吸浆虫3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR的克隆及在滞育与发育变态过程中的表达动态

【目的】3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是保幼激素(JH)合成途径的限速酶。麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是一种典型的专性幼虫滞育昆虫。本研究旨在探讨HMGR基因在麦红吸浆虫滞育和发育变态过程中的作用。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆麦红吸浆虫滞育前幼虫HMGR基因全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析HMGR基因核苷酸和其编码的蛋白氨基酸序列特性;采用qPCR技术测定其在麦红吸浆虫滞育不同时期3龄幼虫及不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹和后蛹以及雌雄成虫)中的mRNA表达水平。【结果】克隆获得一条麦红吸浆虫HMGR基因全长cDNA序列,命名为SmHMGR(GenBank登录号: MG876766)。该基因全长2 548 bp,其中开放阅读框长2 328 bp,编码775个氨基酸,预测的蛋白分子量为84.16 kD,理论等电点为8.29。序列分析发现该基因编码的蛋白具有HMGR蛋白家族典型的HMG-CoA-reductase-classⅠ催化功能域及其他保守功能基序;序列比对和系统发育分析表明,SmHMGR与达氏按蚊Anopheles darling等长角亚目(Nematocera)昆虫HMGR的相似性最高、亲缘关系最近。SmHMGR在麦红吸浆虫滞育前的3龄早期幼虫中表达量显著升高,进入滞育后一直维持较高水平,并在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月达到最高。SmHMGR在蛹期表达量低于幼虫期,预蛹期表达量最低;在雌成虫中表达量显著高于在蛹和雄成虫中的表达量。【结论】SmHMGR的表达与麦红吸浆虫发育密切相关,可能在滞育诱导、维持及滞育后静息状态的维持及生殖中发挥作用,其表达量的降低可能参与了幼虫到蛹的变态。     

小菜蛾U6 snRNA基因的克隆及作为miRNA定量表达分析内参基因的评价

【目的】克隆小菜蛾Plutella xylostella (L.)小分子非编码RNA U6的cDNA序列,并评价其是否适合作为定量检测小菜蛾microRNA (miRNA)表达量的内参基因。【方法】本研究采用RT-PCR 克隆获得了小菜蛾4龄幼虫核小RNA(small nuclear RNA, snRNA) U6的cDNA序列,并用定量PCR法检测了U6及8种miRNAs在小菜蛾不同发育阶段及不同杀虫药剂处理后的表达稳定性。【结果】小菜蛾U6的cDNA序列全长 94 bp,与其他昆虫U6的核苷酸序列一致性达98.9%。用geNorm和RefFinder软件分析荧光定量PCR结果表明,U6在小菜蛾卵、1-4龄幼虫、蛹和成虫7个不同发育阶段表达稳定;用马拉硫磷、毒死蜱、辛硫磷、灭多威、呋喃虫酰肼、高效氯氰菊酯、氯虫苯甲酰胺、溴虫腈和Bt 9种不同作用机理的杀虫药剂处理3龄末幼虫48 h,对U6的表达水平无显著影响。【结论】小菜蛾U6表达水平不受不同发育阶段和不同杀虫药剂处理的影响,符合作为内参基因的基本特点,可作为定量PCR法评价小菜蛾miRNA或其他非编码小分子RNA表达水平的内参基因。研究结果为小菜蛾miRNA表达水平的准确定量奠定了基础。     

ATP6蛋白影响异沙叶蝉对小麦蓝矮植 原体的传播效率

【目的】探索异沙叶蝉Psammotettix alienus ATP6蛋白对小麦蓝矮植原体(wheat blue dwarf phytoplasma, WBDp)传播效率的影响。【方法】将异沙叶蝉mRNA反转录合成cDNA,构建分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库;用WBDp的虫传相关蛋白P2-4为诱饵,从异沙叶蝉cDNA文库杂交筛选互作蛋白;通过RNAi沉默ATP6基因,验证ATP6蛋白对异沙叶蝉3龄若虫传播WBDp的影响。【结果】构建了异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统cDNA文库,用P2-4从cDNA文库中杂交筛选获得了ATP6等多种互作蛋白。RNAi结果发现沉默ATP6基因后异沙叶蝉3龄若虫的WBDp传播率比对照组显著下降了23.33%±3.33%,表明ATP6是异沙叶蝉参与WBDp传播的关键蛋白。【结论】明确了异沙叶蝉ATP6是参与WBDp传播的一个关键蛋白。为进一步探明异沙叶蝉传播WBDp的分子机制和植原体病害的田间防治提供了理论基础。     

暗黑鳃金龟UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因的克隆、原核表达及功能分析

【目的】本研究旨在阐明暗黑鳃金龟Holotrichia parallela UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UAP)基因HpUAP的序列特征和功能。【方法】通过PCR方法从暗黑鳃金龟2龄幼虫中扩增HpUAP全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;构建pET30a-HpUAP重组表达载体,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达;利用qRT-PCR检测HpUAP在暗黑鳃金龟幼虫不同发育阶段(1-3龄幼虫)和3龄第2天幼虫不同组织(体壁、中肠、直肠、回肠、马氏管和脂肪体)中的表达量。利用RNAi沉默暗黑鳃金龟2龄幼虫体内HpUAP基因后,观察其生长发育和存活情况,并测定RNAi 72 h后其HpUAP表达量和体壁几丁质含量。【结果】PCR扩增获得暗黑鳃金龟HpUAP 全长cDNA序列(GenBank登录号: MW676788),开放阅读框长1 461 bp,编码486个氨基酸残基,蛋白分子量约为53.9 kD。系统进化分析发现HpUAP与似牛嗡蜣螂Onthophagus taurinus UAP的氨基酸序列以较高的置信度聚为一个分支。经IPTG诱导可表达53.9 kD的HpUAP蛋白,与预期大小一致。发育表达谱结果表明HpUAP在1龄第1天和3龄第1天暗黑鳃金龟幼虫中表达量较高,组织表达谱结果表明HpUAP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫中肠和体壁中表达量较高。HpUAP RNAi导致暗黑鳃金龟2龄幼虫生长与行动缓慢,体表颜色加深并皱缩;RNAi处理72 h后,与对照组（dsGFP注射组）相比,dsHpUAP注射组HpUAP表达量下降了93.06%,死亡率增加了40%左右,表皮几丁质含量下降了约29%。【结论】结果说明HpUAP参与几丁质代谢,在暗黑鳃金龟幼虫的生长发育过程中起关键作用。     

白背飞虱SfABCD1对杀虫剂胁迫的响应表达

[目的]ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC transporter)是一个庞大的膜转运蛋白超家族,在昆虫生长发育和抗药性方面具有重要作用.本研究旨在通过克隆白背飞虱Sogatella furcifera ABCD1基因,并测定其在杀虫剂胁迫下的表达模式,为后续的功能...     

棉铃虫剂量补偿相关基因Hamsl1的鉴定与功能分析

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera的剂量补偿(dosage compensation, DC)分子机制尚不清楚。本研究旨在通过克隆棉铃虫雄性特异性致死(male specific lethal, msl) 基因Hamsl1,利用RNA干扰技术明确其是否参与调控棉铃虫剂量补偿。【方法】利用RT-PCR同源克隆棉铃虫Hamsl1基因全长cDNA; 利用qPCR技术研究Hamsl1基因在棉铃虫不同发育时期的表达谱;通过显微注射Hamsl1 siRNA到棉铃虫3龄幼虫中对Hamsl1基因进行RNA干扰后,利用qPCR技术检测15个Z染色体基因的表达情况,分析Hamsl1是否调控Z染色体基因剂量。【结果】成功克隆了棉铃虫Hamsl1基因的cDNA序列,鉴定出Hamsl1基因mRNA存在2种剪接体,分别命名为Hamsl1a(GenBank登录号: MK564008)和Hamsl1b(GenBank登录号: MK564009)。功能域分析发现HaMSL1含有典型的PEHE和coiled-coil功能域,具有MSL1蛋白的特征。qPCR分析表明,Hamsl1基因位于棉铃虫Z染色体上;棉铃虫Hamsl1a与Hamsl1b基因表达均具有发育时期特异性,在成虫期表达量最高,且雌雄化蛹后基因表达量差异显著,具有性别特异性。通过同源比对和qPCR分析,在DNA水平鉴定了15个Z染色体候选基因。显微注射Hamsl1 siRNA于3龄幼虫体内72 h,干扰效率为36.01%~64.27%,并未发生雄性致死现象;与对照组相比,Hamsl1 RNAi处理组中棉铃虫15个Z染色体基因在雄性个体中整体呈现表达量上调趋势,而在雌性个体中平均表达水平差异不显著。【结论】本研究初步探明Hamsl1基因位于棉铃虫Z染色体上,且该基因可能通过抑制雄性棉铃虫Z染色体基因表达,调控棉铃虫Z染色体剂量补偿。本研究为深入研究棉铃虫剂量补偿分子机制和绿色防控棉铃虫提供了理论基础。