激光诱变生淀粉糖化菌黑曲霉S—7原生质体的研究

本研究采用YAG泵浦染料激光器对生淀粉糖化菌黑曲霉S—7的原生质体直接进行辐照。结果表明;原生质体比孢子对激光更为敏感。激光对原生质体的正突变率比对孢子的正突变率高35％,原生质体最高正突变率达70％。突变株与出发菌株相比生淀粉糖化酶活性平均提高39％,最高达102％。     

紫外-激光复合诱变选育天冬氨酸转氨酶高产菌株

对天冬氨酸转氨酶产生菌大肠杆菌XJ-1原生质体进行紫外-激光复合诱变筛选,结果表明,复合诱变对该菌的原生质体有明显的致死作用。以致死率和正突变率为指标,确定了紫外和He-Ne激光照射的最佳时间分别为45 s和40min。在此条件下对大肠杆菌原生质体进行紫外-激光复合诱变,得到3株高产菌株,分别命名为XJ-1-45、XJ-1-86和XJ-1-99,酶活较出发菌株XJ-1分别提高了12.82%、17.37%和26.27%。传代培养表明突变株生产性能稳定。     

紫杉醇产生菌Nodulisporium sylviforme原生质体诱变研究

对酶系组成、pH、酶解温度和酶解时间等影响树状多节孢原生质体制备和再生的因素和原生质体诱变进行了研究。结果表明 ,原生质体制备和再生的最佳条件为 :用pH5.5～ 6.0的0.7mol/LNaCl配制由 3%溶壁酶 + 3%蜗牛酶 + 1 %的溶菌酶 + 3%纤维素酶组成的复合酶系 ( 1ml酶液/2 5 0mg湿菌体 ) ,在 30℃恒温水浴条件下酶解 6h ;然后 ,将获得的原生质体过滤洗涤后 ,在含0.7mol/ LNaCl的PDA再生培养基上 ,采用双层平板培养法再生制备到的原生质体。树状多节孢紫杉醇产生菌原生质体诱变的最佳条件为 :30w紫外灯、距离 30cm、照射 5 0s;UV + 0.6%LiCl复合诱变、照射时间 40s,诱变菌株经初筛和复筛 ,选出了两株高产紫杉醇的原生质体诱变菌株———UV_40-19和UL_50-6,其产量从出发菌株紫杉醇的产量 ( 314.07μg /L)分别提高至 376.38μg/L和392.63μg/L。     

氦氖激光、紫外复合诱变天麻素产生菌华根霉LN-A的原生质体

本文通过研究酶组合、酶浓度、酶作用时间和菌龄等因素对天麻素产生菌华根霉(Rhizopus chinensis) LN-A原生质体制备和再生的影响, 总结出了原生质体制备和再生的最佳条件: 选用对数生长期的菌株, 以蜗牛酶5 mg/mL + 纤维素酶5 mg/mL + 溶菌酶2 mg/mL 30°C保温处理2 h, 原生质体形成率达5.8×107, 原生质体再生率为5.7%。在此基础上首次利用He-Ne激光、紫外线复合诱变天麻素合成菌的原生质体, 当选用15 mW的He-Ne激光辐射原生质体20 min, 再用紫外辐照150 s时获得了转化率及天麻素得率都明显提高的突变株, 其天麻素得率比出发菌株提高20%以上。     

黄曲霉菌原生质体的制备和再生技术优化

黄曲霉菌的遗传转化是研究黄曲霉菌致病相关功能基因的前提和基础,而原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。本文分别以黄曲霉孢子和菌丝为材料,研究不同条件下黄曲霉原生质体的形成和再生,结果表明,黄曲霉孢子在酶液浓度为纤维素酶∶蜗牛酶∶溶壁酶=1.5%∶1.5%∶1.5%,30℃酶解3 h,原生质体制备率高达97.3%,再生率达89.2%;黄曲霉菌丝在菌龄为42 h,酶液浓度为纤维素酶∶蜗牛酶∶溶壁酶=1.5%∶1.5%∶1.5%,30℃酶解1 h,可获得最高原生质体产量为2.0×10^6个/m L,再生培养基中以1 mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂时,原生质体再生率达5.5%。故本实验条件下,黄曲霉孢子原生质体的形成和再生优于菌丝。     

激光诱变筛选高产植酸酶黑曲霉菌株的研究

用1.06um,15KHz高重复率声光调QNd：YAG激光以20W和15W的辐照功率分别照射产植酸酶的黑曲霉孢子液和原生质体液不同时间,检定再生菌落数并经透明圈初筛和摇瓶复筛,测定诱变菌株所产植酸酶酶活。结果表明：20W的功率辐照黑曲霉孢子1′以上,致死率近乎100…,15W功率辐照原生质体液20″-4′,存活率在8.571％-117.14％之间,正变率在27.45％-100％之间,正变辐度60.69％-124.96％,说明原生质体比孢子耐受激光诱变的能力强,并且诱变效果好。筛选到了一株酶活提高达3.75倍的单个变异菌株。     

黄绿木霉原生质体诱变育种研究

利用正交实验方法研究了影响黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)原生质体形成的因素,并利用紫外线、硫酸二乙酯、氯化锂几种因素复合诱变原生质体筛选高产纤维素酶菌株。影响原生质体形成的因子顺序是酶系统>菌龄>酶解时间>酶解温度,原生质体形成的最佳条件是0.5%蜗牛酶 0.5%溶菌酶 1.0%纤维素酶,菌龄为18h,酶解时间为3.0h,酶解温度为32℃;在该条件下原生质体产量可达到4.25×106个mL-1。Ca2 和PEG对提高原生质体再生率的作用明显;复合诱变后得到酶活显著提高、遗传性能稳定的诱变株T-14,其EG酶活与BG酶活分别提高了58.43%、44.48%。     

竹黄菌原生质体的制备与再生分析

为了提高竹黄菌(Shiraia bambusicola P.Hennings)中原生质体用于遗传转化时的转化效率,研究竹黄菌原生质体制备及再生的最佳条件,建立竹黄菌原生质体的高效遗传转化体系。本研究以竹黄菌为材料,采用正交试验分析方法,对影响竹黄菌原生质体制备及再生的主要因素,不同酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂及菌龄、不同再生培养基等进行了系统的研究。结果表明,以0.6 mol/L Na Cl为稳渗剂,用组合酶(质量分数1%裂解酶和质量分数1.5%崩溃酶按4:6体积比混合)在33℃条件下对菌龄为6 d的菌丝体酶解2 h,原生质体产量最高,达到10.57×10~6个/m L;以0.6 mol/L蔗糖为稳渗剂,用组合酶(质量分数1%裂解酶和质量分数1.5%崩溃酶按4:6体积比混合)在29℃条件下对菌龄为4 d的菌丝体酶解2 h,原生质体再生率最高,为0.293%;最适合竹黄菌原生质体再生的培养基是TB3再生培养基。     

金龟子绿僵菌原生质体形成和再生的研究

用0.5%纤维素酶和0.5%蜗牛酶的混合酶液,以0.6mol/L KCl为渗透压稳定剂,pH6.5时,30℃处理菌龄为24小时的金龟子绿僵菌3-4小时,可从1克湿菌丝获得5×10⁷个以上的原生质体。原生质体在祭氏培养基上再生率仅为0.1—1.2%。但原生质体先在液体中培养再转移到固体平皿上,再生率可提高到8%。实验还观察和确证了原生质体的形成及其再生。     

毛栓菌原生质体制备和再生及单核菌株产漆酶特性

毛栓菌Trametes hirsuta能有效地降解木质素,在生物燃料、制浆和饲料工业等方面具有很高应用价值。为了获得遗传性能稳定的T. hirsuta单核菌株,研究了其菌丝生长培养基的类型、菌丝生长时间（菌龄）、酶解时间、原生质体纯化离心速度和原生质体再生培养基类型对T. hirsuta YJ-9-1原生质体制备与再生的影响;采用DAPI染色和锁状联合缺失的观察,从再生株中筛选单核菌株并考察其产酶特性。结果表明：采用YGM菌丝生长培养基、88h菌龄、1h酶解时间、4,000r/min原生质体纯化离心速度以及YGMS再生培养基,最终可获得密度大约为5.0×106个/mL的原生质体悬浮液和9.1%的再生率;从200株再生菌株中筛选出了3株单核菌株,其中一株单核菌株D-2-1的漆酶产量比原菌T. hirsuta YJ-9-1明显提高,在第12天其漆酶酶活为771.67U/L,是原菌的1.51倍。     

高效除藻真菌云芝F21a遗传转化体系的建立

以蓝藻高效降解菌云芝F21a (Trametes versicolor)为出发菌株,对其原生质体的制备、再生条件及限制性内切酶介导的遗传转化进行研究。结果表明：在PDA培养基上,28 ℃培养4 d的菌丝最适于原生质体制备; 0.6 mol/L KCl为最适等渗条件;30 ℃混合酶液（2% cellulase+2% snailase+2% lywallzyme）酶解4 h,原生质体产量达到2.375×10⁷个/mL,此时再生率达0.74%。采用限制性内切酶介导技术可将质粒pAN7-1导入云芝F21a的原生质体,在含有150 μg/mL 潮霉素的RM培养基中能够获得再生菌株,PCR验证初步表明该质粒已经转入云芝F21a原生质体。连续传代转接显示,阳性转基因菌株外源基因可以稳定表达,本结果为研究真菌高效消除蓝藻的分子机制奠定基础。     

黑果枸杞原生质体培养及植株再生

该研究以黑果枸杞(Lycium ruthenicum)无菌苗为材料,建立了愈伤组织来源的原生质体再生体系,采用ISSR和FCM技术对再生植株进行了遗传稳定性分析。结果表明：(1)黑果枸杞叶片愈伤组织是产生原生质体的最好材料,在含0.5 mg·mL^-1甘露醇的酶液中,继代1次的叶片愈伤组织中原生质体产量为7.77×10⁶个·g^-1,活力为92%。(2)改良MS培养基 固体液体双层培养(MS₂ 固液双层)是培养原生质体的最好方式,培养10 d的原生质体分裂频率为45.9%,培养20 d的细胞团形成频率为22.9%。(3)在1.5 mg·mL^-1 6 BA+0.1 mg·mL^-1 IBA+MS培养基中,叶片愈伤组织产生的原生质体可分化获得再生植株。(4)ISSR分析显示,再生植株的平均遗传相似系数为0.88;FCM显示再生植株为二倍体,与亲本植株一致。该研究结果为进一步研究枸杞体细胞杂交技术转移野生植物抗逆遗传性状提供科学依据,为枸杞优良品种的选育奠定了基础。     

茯苓原生质体制备与再生条件的研究

研究了酶、酶解时间、菌龄、稳渗剂等对茯苓原生质体制备与再生的影响。茯苓原生质体制备的最佳条件为:纤维素酶(1．5%)和蜗牛酶(1．5%)的等量混合酶解系统,酶解时间3h,7d菌龄菌丝,产量可达1．77×10~7个/mL。以甘露醇为稳渗剂,采用CYM再生培养基,酶解时间3h,7d菌龄菌丝,其原生质体再生率最高,为0．164%。这一结果为茯苓通过原生质体技术进行菌种改良提供了重要技术参数。     

卷枝毛霉孢子原生质体的制备与再生

为了构建高产γ-亚麻酸的卷枝毛霉稳定遗传转化体系,利用酶解法对卷枝毛霉(Mucor circinelloides sp.)EIM-10的孢子进行原生质体制备。研究酶液组成、渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间等对卷枝毛霉孢子原生质体形成和再生的影响,建立了制备卷枝毛霉孢子原生质体的最适条件:1%纤维素酶和2%溶壁酶为酶解体系,0.5mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,酶解温度32℃,酶解时间2.5 h,再生培养基为0.5 mol/L NaCl高渗培养基。用双层平板培养法进行原生质体再生,在此条件下原生质体的形成量为1.2×106个/mL,再生率为70.5%。     

小花棘豆Embellisia内生真菌原生质体的制备与再生研究

旨在获得数目多且活力高的小花棘豆Embellisia内生真菌的原生质体,分析和探讨该内生真菌原生质体制备与再生的最佳条件,为后续外源基因转化奠定基础。利用酶解法对制备小花棘豆Embellisia内生真菌菌丝的原生质体,研究酶解液成分、p H、温度、渗透压稳定剂、酶解时间及菌龄对原生质体制备和再生的影响;原生质体在TB3培养基上再生后,研究酶解时间对原生质体再生的影响。结果显示,2.5%(W/V)lysing enzymes、2%(W/V)纤维素酶和3%(W/V)蜗牛酶3种混合酶处理,菌龄为10 d,当酶解温度为30℃、p H5.8、1.2 mol/L Mg SO4为渗透压稳定剂,在80 r/min水平摇床酶解8 h时,原生质体浓度较高,达4.42×105个/m L;酶解时间6 h时再生率最高,达46.7%。     

白腐真菌原生质体制备和再生条件的研究

对影响白腐真菌(5．776)原生质体制备和再生的条件：包括菌龄、水解酶液的种类及浓度、酶解温度、酶解时间、再生培养基的稳渗剂的选择进行了研究。通过单因素比较分析和正交实验得到最适合的白腐真菌原生质体制备和再生条件。结果表明：当菌龄为58h,采用1%纤维素酶和1%蜗牛酶(2：1)混合液,酶解温度30℃,酶解时间180min,用0．7mol/L氯化钠作渗透压稳压剂,白腐真菌(5．776)原生质体的形成数和再生率均比优化前大为提高,原生质体形成量为8．36×10~5个/mL,原生质体再生率为9．12%。     

木质层孔菌原生质体的制备与再生条件的研究

目的：提高木质层孔菌原生质体的产量和再生率,为进一步诱变育种提高菌株产木质纤维素酶活力打下基础。方法：通过单因素实验分别筛选合适的酶浓度、菌丝的菌龄、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂与pH值。结果：在酶解液浓度为2.0%纤维素酶＋2.0%蜗牛酶、菌龄60h、酶解温度32℃、酶解时间3h,以0.8mol/L的NaCl溶液为渗透压稳定剂,pH值为5.0时,原生质体形成量达4.13×10^5个/mL,再生率可达6.95%。有效地提高了木质层孔菌原生质体的产量和再生率。     

兽疫链球菌原生质体激光诱变及高产菌株筛选*

探索了透明质酸 (Hyaluronicacid)产生菌—兽疫链球菌 (Streptococcuszooepidemicus)原生质体制备与再生的最佳条件。研究了酶浓度、酶解时间、高渗液的选择、预处理及高渗预培养等因素的影响。确定了最佳条件为 :经 12%甘氨酸预处理及高渗预培养共同作用2h后 ,用 5 0U mL溶菌酶 ,在NaCl高渗体系中 ,于 39℃作用 60min。在此条件下 ,原生质体形成率可达 94.6% ,再生率可达18.5 %。用不同功率的He Ne激光照射不同时间诱变原生质     

产脂肪酶菌株筛选及柠檬酸杆菌产酶条件优化

脂肪酶可以催化甘油三酯水解成脂肪酸和甘油,已广泛应用在工业领域,而获得产酶微生物是研究的基础。采用油脂平板法筛选出1株脂肪酶产生菌。经16S rRNA序列分析可知,该菌株属于柠檬酸杆菌(Citrobacter werkman and Gillen)。单因素试验对其进行产酶条件优化,优化后产酶条件（g/L）：淀粉2.0,KH₂PO₄ 1.0,K₂HPO₄·3H₂O 2.2,(NH₄)₂SO₄ 1.0,MgSO₄·7H₂O 0.1,牛肉膏2.0,橄榄油10.0 mL,pH 7.5,接种量1.5%(v/v),37 ℃培养43 h。获得最大酶活为384 U/mL,是优化前的13倍。可以利用该菌制备脂肪酶。     

He-Ne激光对金针菇SOD高产株的诱变效应

用He-Ne激光辐照诱金针茹（Flammulina Velutipes）的原生质体、菌丝体片段,分生孢子悬液,并进行初筛、复筛及突变株遗传稳定性研究。结果表明：采用原生质体进行诱变,其正突变率,单株SOD产量提高率,产SOD遗传稳定性均高于菌系体与分生孢子。激光诱变原生质体是获得金针茹SOD高产株的有效途径。