基于HPLC-MS的西藏天麻的化学成分分析与品质鉴定

目的:天麻具有许多药理作用和重要开发价值,通过探索天麻的未知化学成分和鉴定西藏天麻种群的品质,为深入研究、开发和利用西藏优良天麻种群提供科学技术支持。方法:本研究采用HLPC-MS(液质联用)技术测定西藏天麻的化学成分;采用高效液相色谱技术测定西藏6个天麻种群的生化指纹图谱,利用天麻素峰面积、数学公式和SPSS软件,计算和比较西藏6个天麻种群的平均天麻素含量和各种化学成分分离峰的总面。结果:从天麻块茎中发现了33个未报道的化学物质;西藏天麻的生化指纹图谱具有7个较大的共有特征分离峰,分别位于1.854、2.759、7.279、7.591、8.500、9.557、10.753min;根据生化指纹图谱特征可将它们分为三个主要类型;凡是带有一型生化指纹图谱的天麻个体和种群往往含有更高的天麻素和更大的分离峰总面积,品质更优良。结论:西藏天麻种群3和种群6以一型生化指纹图谱为主,其天麻素含量最高,分离峰总面积最大,品质最优良,具有重要研究、开发和保护价值。本研究成果对于天麻的化学成分分析与鉴定、天麻种群和品质鉴定与评价以及西藏天麻的品种选优、资源保护与利用具有重要指导意义和科学价值。     

天麻特异DNA序列的克隆及其在天麻鉴定中的应用

应用改进的RAPD方法测定了名贵中药材天麻基因组DNA指纹图谱;通过选择和回收各种天麻种群共有和优良种群特有的DNA片段,加以克隆、测序和生物信息学分析,证明其中5个DNA序列是未报道的,已被美国基因数据库收录,并运用高效液相色谱技术测定了天麻样本的有效成分天麻素含量。运用PCR技术研究了这些DNA序列在9个天麻种群中的分布及其与天麻素含量的关系。结果表明这5个DNA序列在这些天麻种群中的分布各不相同,其中DNA序列1是所研究的全部天麻种群共有、而其伪品没有的特异DNA分子标记;DNA序列2可能与天麻的天麻素含量高有关。这些DNA标记序列可用于天麻的真伪鉴别、品种鉴定和优选优育等。     

天麻种质资源的SSR指纹图谱研究

天麻(Gastrodia elata Bl.)为中国珍稀濒危传统药用植物,其不同种质之间形态特征差异微小,而药用成分差异较大,种质资源混乱。为了构建天麻种质资源的DNA指纹图谱,该研究应用SSR分子标记技术对天麻的3种变型(乌天麻、红天麻和绿天麻)、12个种群,共计120个样本进行了群体遗传分析。研究结果表明:(1)7对SSR引物均能对天麻样本成功进行PCR扩增且多态性丰富,每对引物的等位基因数(N_a)在5~7之间,平均为6.43;引物多态信息含量(PIC)范围为0.626 2~0.823 5,平均为0.759 5。(2)群体遗传分析结果表明,天麻在物种水平上和变型水平上均有较高的遗传多样性(物种水平:A=6.428 6,H=0.789 0,I=1.682 9;变型水平:A=2.666 6,H=0.523 9,I=0.812 3)。(3)分子方差分析结果显示,种群间和变型间均存在强烈的遗传分化(F_(st)=0.558 6,F_(ct)=0.381 8)。(4)种群聚类分析结果显示,相同变型的天麻种群首先聚在一起,3种变型能被完全分开,SSR指纹图谱在变型水平上鉴定效率良好;从120个样本中共检测出有112种基因型,Simpson指数(D)为0.99 8,说明SSR指纹图谱对天麻样本在个体水平上也有着良好的鉴定效率。该研究结果揭示了天麻的遗传背景,并建立了天麻的SSR指纹鉴定图谱,为其种质资源的保护、选育及药材鉴定奠定了科学依据与技术支撑。     

不同产地麦冬’H—NMR指纹图谱研究

目的：建立不同产地中药麦冬1H—NMR指纹图谱,为麦冬及其提取物质量控制提供依据。方法：采用1H-NMR建立不同产地麦冬甲醇提取物的指纹图谱。结果：7个样品的主要化学成分糖、脂肪族、皂苷和高异黄酮的氢信号峰有高度的相似性,但不同麦冬品种、不同产地,1H—NMR指纹图谱有较大的差异,可以此区分。结论：1H-NMR指纹图谱不但可以鉴定不同麦冬品种,还可以区分不同产地的麦冬。     

新疆雪莲的高效液相指纹图谱及液-质联用分析

建立新疆雪莲药材的高效液相指纹图谱。以Luna C18为分析柱,用乙腈-0.1%醋酸梯度洗脱,获得分离度较好的新疆雪莲药材HPLC分析条件。通过10批样品的分析和对照,标示出12个共有峰,相似度分析大于0.92。最后通过HPLC-UV-MS/MS联用分析鉴定出其中7个化学成分。该方法可为新疆雪莲药材指纹图谱和质量分析方法的建立提供参考。     

RAPD条件优化及天麻基因组DNA多态性分析

建立了RAPD扩增条件快速优化程序与方法．并应用于天麻基因组DNA扩增条件的优化及多态性的测定：获得了天麻基因组DNA的RAPD扩增优化条件和DNA指纹图谱;分析了模板DNA、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶等的浓度和退火温度对RAPD扩增的影响．结果表明：天麻基因组DNA用引物S1扩增的片段具有更明显的多态性,这种指纹图谱更适合于天麻遗传分化研究;而用引物S12扩增的DNA指纹图谱具有更大的相似性,这种指纹图谱更适合于天麻真伪鉴别．该方法使RAPD扩增条件优化过程实现了程序化和数量化,是获得RAPD优化条件的简便快速、经济实用方法．应用该方法进行RAPD扩增,可获得图谱清晰、稳定可靠的实验结果．     

不同产地麦冬1H-NMR指纹图谱研究

目的:建立不同产地中药麦冬1H-NMR指纹图谱,为麦冬及其提取物质量控制提供依据.方法:采用1H-NMR建立不同产地麦冬甲醇提取物的指纹图谱.结果:7个样品的主要化学成分糖、脂肪族、皂苷和高异黄酮的氢信号峰有高度的相似性,但不同麦冬品种、不同产地,1H-NMR指纹图谱有较大的差异,可以此区分.结论:1H-NMR指纹图谱不但可以鉴定不同麦冬品种,还可以区分不同产地的麦冬.     

基于化学模式识别和熵权TOPSIS法分析木棉花不同部位的差异CSCD

基于HPLC指纹图谱比较木棉花不同部位(花瓣、花萼、雄蕊)化学成分的差异性,并综合评价木棉花不同部位的质量。建立木棉花及其不同部位的HPLC指纹图谱,采用相似度评价、化学模式识别和熵权TOPSIS法对其化学成分进行差异性研究。建立了15批木棉花药材的HPLC指纹图谱,确定了13个共有峰,并指认了其中4个特征峰,部分批次花瓣与雄蕊存在特征峰丢失;与药材对照指纹图谱相比,花瓣、花萼、雄蕊的相似度分别为0.280、0.976、0.364。热图聚类分析显示,花瓣和雄蕊聚为一类,化学成分主要富集在花萼中。主成分分析显示,花瓣与雄蕊的化学成分更为接近。正交偏最小二乘法判别分析筛选出7个化学成分是引起木棉花不同部位差异的主要变量。熵权TOPSIS法分析显示,木棉花花瓣、花萼、雄蕊的最优解欧氏贴近度均值分别为0.416、0.485、0.388。木棉花不同部位HPLC指纹图谱存在显著差异,该方法可反映木棉花不同部位质量差异性,对木棉花药材的质量控制和整体评价具有重要意义。     

叶下珠药材HPLC指纹图谱的比较研究

采用反相高效液相色谱法,对叶下珠药材不同产地、不同采收期、不同部位指纹图谱进行测定和比较分析,并与中成药叶下珠胶囊的HPLC指纹图谱进行了比较研究。结果显示:(1)建立了叶下珠药材的HPLC特征指纹图谱,标定18个共有峰,利用对照品指认4个峰;11批(来源地不同)叶下珠样品的HPLC图谱相似度(相合系数,均值)在0.89~0.99之间。(2)7批不同采收期的叶下珠药材的HPLC指纹图谱相似度在0.94以上,各共有峰的峰面积大多随生长期而增加,至10月5日达到最高,建议叶下珠药材应于每年的10月上旬进行采收。(3)不同部位叶下珠药材HPLC指纹图谱相似度分析发现,叶、果的相似度较高(0.98~0.99),根、茎的相似度较低(0.86~0.87),说明根、茎中各成分含量较低,建议采收叶下珠药材的地上部分即可。(4)比较叶下珠胶囊和叶下珠药材的指纹图谱,发现二者的化学成分非常相似,但峰面积差异较大,其差异可能是由于加工过程所致。该研究所建立的HPLC指纹图谱分析方法简便、重现性好,可用于叶下珠药材及中成药的鉴定与质量评价。     

基于GC-MS分析不同基原车前草挥发油成分的异同CSCD

比较不同基原车前草挥发油成分的异同。采用水蒸气蒸馏法提取14批次车前草挥发油,气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分离鉴定各色谱峰的化学成分;将样品挥发油指纹图谱导入指纹图谱相似度评价系统,以平车前草P1为参照图谱,进行多点校正,得相似度;采用聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对14批次样品挥发油检测结果进行分析。结果显示,从14批样品挥发油中共鉴定出62种化学成分,9种共有成分,均以棕榈酸、亚油酸、α-亚麻酸为主要成分;14批次样品指纹图谱高度相似,相似度在0.967~0.999;HCA和PCA均不能将两种不同基原的车前草按照品种分为两类。上述结果表明车前草与平车前草挥发油成分相似度较高,其作为同一药材入药具有一定的科学依据。     

Relationships Among Genetic Makeup, Active Ingredient Content, and Place of Origin of the Medicinal Plant Gastrodia Tuber

Gastrodia tuber and its component gastrodin have many pharmacological effects. The chemical fingerprints and gastrodin contents of eight Gastrodia populations were determined, and the genomic DNA polymorphism of the populations was investigated. Genetic distance coefficients among the populations were calculated using the DNA polymorphism data. A dendrogram of the genetic similarities between the populations was constructed using the genetic distance coefficients. The results indicated that the genomic DNA of Gastrodia tubers was highly polymorphic; the eight populations clustered into three major groups, and the gastrodin content varied greatly among these groups. There were obvious correlations among genetic makeup, gastrodin content, and place of origin. The ecological environments in Guizhou and Shanxi may be conducive to evolution and to gastrodin biosynthesis, and more suitable for cultivation of Gastrodia tubers. These findings may provide a scientific basis for overall genetic resource management and for the selection of locations for cultivating Gastrodia tubers.     

野生天麻DNA导入马铃薯实现遗传转化的研究

采用浸苗法将野生天麻总DNA导入马铃薯试管苗,对筛选得到的转化植株进行蛋白及药用成份的分析。结果显示:(1)在200株转化的马铃薯中有21株的紫外扫描图谱与正常对照组有显著差异,且在220nm有明显吸收峰。(2)5株经PCR扩增出野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因。(3)转基因马铃薯与正常马铃薯的蛋白表达有明显差异,并且在转基因马铃薯中有一条与野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)相同的条带。而正常马铃薯中无此条带。(4)通过薄层层析法检测出3株转基因马铃薯表达野生天麻的有效药用成份天麻素。说明采用浸苗法进行外源总DNA导入是可行的。     

Determining the specific DNA sequences of the Gastrodia tuber and their potential importance

The Gastrodia tuber, as well as the gastrodine extract derived from it, has been found to have many pharmacological effects. The gastrodine content of different tuber populations was determined, and their genomic DNA fingerprints were investigated. Through recovery, cloning, sequencing and bioinformatics analyses of DNA fragments, five DNA sequences were proved to be new discoveries. Using the PCR technique, we further studied the distribution of the sequences in eight Gastrodia populations, as well as their correlation with gastrodine content. The distribution of the five DNA sequences varied greatly among the populations. DNA sequences 1 and 5 were found in all the populations studied and determined to be specific DNA molecular markers that differentiate Gastrodia from other species. DNA sequence 2 was found only in the populations showing the highest gastrodine content. Hence, these sequences can be applied to identify genuine Gastrodia tubers and to optimise the selection of better populations.     

Chemical fingerprint analysis of rhizomes of Gymnadenia conopsea by HPLC-DAD-MSn

A high-performance liquid chromatography-diode array detection-tandem mass spectrometry (HPLC-DAD-MS(n)) method has been firstly developed for chemical fingerprint analysis of rhizomes of Gymnadenia conopsea R. Br. and rapid identification of major compounds in the fingerprints. Comparing the UV and MS spectra with those of reference compounds, seven main peaks in the fingerprints were identified as adenosine (1), 4-hydroxybenzyl alcohol (2), 4-hydroxybenzyl aldehyde (3), dactylorhin B (4), loroglossin (5), dactylorhin A (6) and militarine (7). Compounds 4-7 were succinate derivative esters and firstly discovered from this species. The Computer Aided Similarity Evaluation System (CASES) for chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine was employed to evaluate the similarities of 10 samples of the rhizomes of G. conopsea collected from Sichuan, Qinghai and Hebei provinces, Tibet autonomous region of China, and Nepal. These samples from different sources had similar chemical fingerprints. This method is specific and may serve for quality identification and comprehensive evaluation of this traditional Tibetan remedy.     

太子参商品药材及其四倍体植株块根的高效液相指纹图谱

对不同产地太子参〔Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax〕商品药材及其四倍体植株的块根进行了高效液相指纹图谱分析。结果表明,10个批次的不同产地太子参商品药材与经选育获得的6个株系太子参同源四倍体植株块根的HPLC-UV指纹图谱相似度较高,均在0.9以上。选取15个特征峰并大致判断其峰位和比例关系,构成太子参特有的HPLC色谱指纹图谱,为太子参药材鉴别、品质评价及优良品种的选育提供可靠依据。     

连钱草药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究

建立了不同产地连钱草药材的高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱,并进行了比较。连钱草药材采用体积分数75%乙醇蒸馏提取;采用毛细管区带电泳法制定指纹图谱,电泳条件如下:未涂层融熔石英毛细管50μm I.D.×375μm O.D.(总长62 cm,有效长度53.5 cm),电泳缓冲液为含体积分数15%乙腈的50 mmol.L-1硼酸缓冲液(pH9.2),检测波长278 nm,操作电压25 kV,柱温25℃;以对乙酰氨基酚为参照物,建立了连钱草药材的数据化指纹图谱(相对迁移时间和相对峰面积)。结果表明:5种连钱草药材(4个产地和对照药材)具有16个共有指纹峰,不同产地连钱草药材指纹图谱的峰重叠率都低于60.3%,共有峰相对峰面积及8强峰均差异较大;连钱草药材的主要化学成分种类和质量分数均因产地不同而有差异;HPCE指纹图谱法具有较好的稳定性、精密度和重现性,简便,快速,可作为连钱草药材的质量控制方法。     

不同产地南方红豆杉枝叶的紫杉醇含量及其指纹图谱的比较分析

采用HPLC法对来源于6个产地(陕西周至和汉中;甘肃天水;安徽胡乐、聂家山和仙寓山)的12份野生南方红豆杉[ Taxus chinensis var.mairei( Lemée et Lévl.) Cheng et L.K.Fu]枝叶中的紫杉醇含量进行了比较分析,并对不同产地南方红豆杉指纹图谱的相似度进行了比较和特征指纹图谱的构建.结果表明:不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇的含量有明显差异,来源于陕西和甘肃的枝叶样品中紫杉醇含量明显高于来源于安徽的样品,以产自陕西周至的枝叶样品中紫杉醇含量最高(0.019 3 mg·g-1).各样品的指纹图谱均有12个共有峰,其中9号共有峰的保留时间(32.75 min)与紫杉醇标准品一致,被确定为南方红豆杉指纹图谱的参照峰(s).各共有峰相对保留时间的RSD值均低于1％,但相对峰面积的RSD值均高于40％,说明各样品共有峰的保留时间稳定,但相对含量差异较大.除来源于安徽聂家山的2个样品外,其他样品的相似度值均在0.8以上,说明各样品间指纹图谱的相似度较高.根据12个样品的指纹图谱建立了南方红豆杉枝叶的特征指纹图谱,可用于南方红豆杉的鉴定及质量控制.由测定结果推测:不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量的差异可能与生长环境的差异有关.     

不同品种玫瑰花药材的HPLC指纹图谱研究

目的:建立中药玫瑰花的高效液相色谱指纹图谱,为科学评价和有效控制其质量提供可靠的方法。方法:用HPLC-UV方法测定了11份玫瑰花样品,采用中国药典委员会颁布的"中药色谱指纹图谱相似度评价"2004A系统建立了玫瑰花药材指纹图谱,并进行相似度评价和聚类分析。结果:11份玫瑰花样品的HPLC指纹图谱有18个共有峰,有10份样品相似度都在0.8以上,聚类分析时归为一类。结论:建立了玫瑰花不同品种的HPLC指纹图谱,并比较了其之间的差异,该方法稳定、可靠、精密度高、重复性好,可为中药玫瑰花的质量评价体系的建立提供科学依据。