高转移倾向乳腺癌细胞中p-ERK促进增殖和迁移作用的信号转导途径

在建立乳腺癌细胞MCF-7高转移倾向亚克隆LM-MCF-7细胞株的基础上,为阐明LM-MCF-7细胞具有更强增殖和迁移能力的分子机制,对其相关分子及其信号转导途径进行了探讨.免疫印迹结果显示,与MCF-7细胞相比,LM-MCF-7细胞中p-ERK1/2水平显著升高.流式细胞术和“伤口愈合”实验结果表明,ERK1/2的特异性抑制剂PD98059可明显抑制LM-MCF-7细胞的高增殖和高迁移能力.免疫印迹检测发现,与MCF-7细胞相比,LM-MCF-7细胞中与增殖和迁移相关的因子,如β-catenin、细胞周期蛋白D1、磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）和肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的水平呈明显增高,PD98059对这些因子水平的增高具有抑制作用.免疫荧光染色显示,LM-MCF-7细胞中β-catenin分布在细胞核中,应用PD98059处理后,β-catenin主要分布在胞浆中.上述研究结果表明,在LM-MCF-7细胞中活化的ERK1/2水平升高,是导致该细胞增殖和迁移能力增强的重要原因之一,与ERK1/2-MLCK-p-MLC和ERK1/2-β-catenin 细胞周期蛋白D1等信号转导途径有密切的关系.     

Rac1/MAPK/ERK 通路介导脂多糖LPS 诱导的人内皮细胞 单层通透性增高机制研究

目的:探讨LPS诱导的人内皮细胞单层通透性改变的分子机制。方法:应用逆转录病毒为载体,感染并筛选稳定表达持续活化型Rac1和主导抑制型Rac1的人HUVEC细胞,应用LPS刺激并观察细胞骨架蛋白F-actin和HUVEC单层通透性的改变。同时应用Western blot方法检测LPS刺激前后细胞中MAPK/ERK信号通路的改变及加入PD98059阻断ERK表达后,细胞内F-actin的改变情况。结果:与正常HUVEC相比较,LPS刺激后,感染活化型Rac1和主导抑制型Rac1的HUVEC中F-actin重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性显著增加。而抑制型Rac1感染后的HUVEC中F-actin无重构现象,同时细胞单层通透性无明显增加。LPS刺激前后,各组细胞中ERK1/2总蛋白均无明显改变。LPS刺激后,感染活化型Rac1的HUVEC中,p-ERK增加。经PD98059阻断后,细胞内p-ERK表达下降同时伴随F-actin解聚发生。结论:LPS诱导的内皮细胞通透性增加是经过Rac1-MAPK/ERK通路介导的。     

ERK1/2信号通路活化对Tamoxifen所致胶质瘤细胞凋亡的影响

为了探讨ERK1/2信号通路在他莫昔芬(tamoxifen, TAM)所致胶质瘤细胞凋亡中的作用,以C6和U87MG胶质瘤细胞为研究对象,经TAM处理后,采用MTT法检测细胞的存活率;倒置显微镜和DAPI染色观察细胞的形态;流式细胞术检测细胞凋亡; Western-blot法检测细胞内ERK1/2磷酸化水平。最后应用ERK1/2抑制剂(PD98059)与TAM共同作用,观察其对胶质瘤细胞内ERK1/2磷酸化水平和细胞凋亡的影响。实验结果显示:TAM可呈浓度和时间依赖性地抑制胶质瘤细胞生长; TAM处理组的细胞凋亡明显增加且呈浓度依赖性;TAM能增加细胞内ERK1/2磷酸化水平;以PD98059阻断ERK1/2的激活,能增强TAM诱导细胞凋亡的作用。实验结果表明TAM能够抑制胶质瘤细胞生长和促进其细胞凋亡, ERK1/2信号通路的激活参与调控TAM所致胶质瘤细胞凋亡。     

CGRP抑制AngⅡ诱导HUVECs的损伤及其ERK1/2信号通路

目的:探索降钙素基因相关肽(CGRP)对经血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的保护作用且CGRP与细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的关系.方法:不同浓度的CGRP、AngⅡ处理体外培养的HUVECs,噻唑蓝比色法检测HUVECs活力;流式细胞仪分析HUVECs凋亡率及其增殖指数;显微镜观察HUVECs的形态学变化;Western blot检测p-ERK1/2的表达.结果:AngⅡ (0.1-100 nmol/L)浓度依赖性降低HUVECs的活力,而CGRP (0.1-1000 nmol/L)浓度依赖性增加HUVECs的活力;HUVECs增殖指数PI值受AngⅡ、CGRP及PD98059(ERK1/2抑制剂)影响;AngⅡ孵育HUVECs在第10min时ERK1/2磷酸化水平可达到最大;CGRP能抑制AngⅡ诱导的HUVECs内ERK1/2磷酸化水平;CGRP8-37(CGRP受体拮抗剂)可部分减弱CGRP抑制ERK1/2磷酸化水平作用;PD98059(ERK1/2抑制剂)作用下,ERK1/2磷酸化水平显著降低,但是对细胞内总ERK1/2水平表达无明显影响.结论:CGRP可抑制AngⅡ对HUVECs的损伤作用,可能与CGRP抑制信号通路ERK1/2有关.     

EB病毒潜伏膜蛋白1调控鼻咽癌中转录因子c-Jun/Ets1间相互作用的实验研究

目的:探讨LMP1对鼻咽癌中转录因子c-Jun和Etsl表达的影响,以及对Etsl和AP-1间相互作用的调控,为LMP1的致瘤机制提供新的依据。方法:选用可调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系pTet-on-LMP1 HNE2(L7细胞),通过针对c-Jun、Ets1的硫代反义寡核苷酸进行阻断,观察LMP1对c-Jun、Ets1表达的影响及其相互作用,蛋白质印迹法检测Ets-1、c-Jun蛋白质表达。免疫共沉淀(IP)结合Western blot研究c-Jun和Ets1相互结合的情况。结果:在不同浓度Dox诱导24 h后,Dox为0.6μg/mL时的c-Jun和Ets1表达均最强。随着Dox诱导时间的延长,L7细胞中c-Jun和Ets1的表达上调,至4 h达到最高。阻断c-Jun表达后,Ets1表达显著降低;阻断Ets1表达后,c-Jun表达显著降低。在Dox诱导的L7细胞总蛋白中,在IP沉淀的Ets1中存在c-Jun表达,并且在Dox 0.6μ/mL时最强;在IP沉淀的c-Jun中存在Ets1表达,同样在Dox 0.6μg/mL时最强。结论:EBV-LMP1可以调控转录因子c-Jun和Ets1表达,且在调控过程中可能存在c-Jun和Ets1间的相互作用。     

内皮素-1对大鼠血管平滑肌细胞产生MCP-1的影响及其机制

目的：观察内皮素-1（ET-1）对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）产生单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响及其机制。方法：培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）。细胞分为2组：ET-1刺激组：以不同浓度ET-1刺激VSMCs不同时间;阻断剂干预组：VSMCs分别与不同阻断剂[ET_AR、ET_BR阻断剂BQ123、BQ788,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）,ERK、p38MAPK、JNK及NF-κB抑制剂PD98059、SB203580、SP600125及PDTC]预先孵育30 min,再加入ET-1刺激24 h。在预定时间,以酶联免疫吸附（ELISA）法、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法分别测定不同因素下VSMCs MCP-1蛋白质及mRNA表达量。VSMCs分别与不同阻断剂（BQ123、BQ788、NAC、PD98059、SB203580及SP600125预先孵育20 min,再加入ET-1刺激5 min,免疫印迹（WB）法测定VSMCs胞浆中细胞外调节蛋白激酶（ERK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）及其各自磷酸化蛋白质的水平。各项检测均重复3次。结果：ET-1能刺激VSMCs MCP-1蛋白质及mRNA表达,其表达量随ET-1浓度及刺激时间的增加呈升高趋势（P<0.05,P<0.01）;BQ123、NAC、PD98059、SB203580及PDTC能显著抑制ET-1诱导的大鼠VSMCs MCP-1蛋白质及mRNA表达（P<0.01）,而BQ788及SP600125对此作用无明显影响。BQ123、NAC与PD98059或SB203580能分别抑制ET-1刺激后VSMCs胞浆内ERK及p38MAPK的磷酸化（P<0.05,P<0.01）,而ET-1对JNK的磷酸化无明显激活作用。结论：ET-1通过ET_AR、ROS、ERK、p38MAPK及NF-κB诱导大鼠VSMCs产生MCP-1。     

细胞外信号调节激酶在小鼠神经干细胞增殖中的作用

本文旨在探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)对小鼠神经干细胞增殖的影响.分离E14.5小鼠皮层神经干细胞,通过Western blot检测神经干细胞增殖过程中磷酸化ERK1/2的表达情况,以及不同浓度PD98059处理对神经干细胞ERK1/2磷酸化及神经球形成的影响,并用CCK-8法检测PD98059对神经干细胞增殖的影响.结果显示:ERK1/2在体外培养的神经下细胞增殖过程中被激活;PD98059显著抑制ERK1/2磷酸化及神经干细胞的成球率,且存在剂量效应依赖关系;加入PD98059后神经干细胞的生长被抑制.以上结果表明,ERK1/2在小鼠神经干细胞增殖中具有重要的作用,阻断ERK1/2信号通路后可抑制神经干细胞的增殖.     

应用cDNA微阵列技术研究EB病毒LMP1介导的鼻咽癌中转移相关基因的表达

探讨EB病毒基因组编码的癌蛋白LMP1对鼻咽癌细胞中转移相关基因表达的影响.采用蛋白质印迹法检测在强力霉素(Dox)诱导下,鼻咽癌细胞系pTet-on-LMP1 HNE2(L7细胞)中LMP1表达的时效和量效关系.应用cDNA微阵列技术建立诱导性LMP1介导鼻咽癌细胞中转移相关基因差异表达谱;运用RT-PCR验证cDNA微阵列筛选差异基因表达的可靠性.与LMP1不表达的L7细胞比较,LMP1高表达的L7细胞中7个基因的表达显著上调,12个基因的表达显著下调.随机选择其中4个基因进行RT-PCR,结果显示,这些基因表达阳性,且与微阵列中的变化趋势一致.LMP1可能通过激活和/或抑制一些转移相关基因的表达而参与鼻咽癌转移过程.     

阻断ERK1/2激酶可增强骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化

骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有很强的诱导间充质干细胞定向成骨分化的能力.但对于其所涉及的相关分子机理了解并不深入.利用BMP9重组腺病毒感染间充质干细胞,Western blot检测ERK1/2激酶的磷酸化,ERK1/2的特异性抑制剂PD98059阻断ERK1/2活性,或以RNA干扰抑制ERK1/2表达,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步分析和揭示ERK1/2对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的调控作用及其可能机制.结果发现:BMP9可以促进ERK1/2激酶的磷酸化,ERK1/2抑制剂PD98059可增强由BMP9诱导的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达和钙盐沉积,并促进由BMP9诱导的Runx2基因的表达和转录活性,以及Smad经典途径的活化;而RNA干扰导致ERK1/2基因沉默同样也可进一步促进BMP9诱导的ALP活性和钙盐沉积,并促进BMP9诱导的间充质干细胞在裸鼠皮下异位成骨.因此,BMP9可以促进ERK1/2蛋白激酶的活化,而阻断ERK1/2蛋白激酶可进一步增强BMP9诱导的成骨分化,ERK1/2极可能对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化起着负向调控作用.     

银杏内酯诱导原代培养神经元低氧诱导因子1α的表达及与ERK通路的关系

目的：研究银杏内酯（Gin）对氯化钴（CoCl2）诱导的化学性缺氧原代培养神经元低氧诱导因子-α（HIF—1α）表达的影响及其与细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路之间的关系。方法：以CoCl2（125μmol／L）诱导的原代培养胚胎小鼠大脑皮层神经元为缺氧模型,观察Gin（终浓度37．5mg／L）对神经细胞形态和活力的影响,Western blot HIF—1α和磷酸化ERK（p-ERK）的表达：运用ERK特异性抑制剂PD98059观察HIF-1α表达与ERK通路之间的关系。结果：Gin能明显提高CoCl2处理的神经细胞的活力、在正常培养的皮层神经元中HIF—1α和p-ERK的表达水平较低,CoCl2处理4h后表达水平明显上调;Gin预处理24h其表达强度进一步提高PD98059能部分抑制CoCl2诱导的HIF-1α的表达,显著抑制p-ERK的表达;预加Gin能完全阻止该抑制作用：结论：Gin对CoCl2诱导的化学性缺氧损伤神经元有保护作用,该作用与HIF-1α表达上调、ERK通路的激活有关     

血管紧张素Ⅱ上调自发性高血压大鼠和Wistar-Kyoto大鼠血管平滑肌细胞外信号调节激酶的信号转导

本文研究血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和Wistar- Kyoto(WKY)大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells．VSMCs)细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated pro- tein kinases,ERKs)信号途径的影响。体外培养SHR和WKY大鼠的VSMCs,先在培养基中加入终浓度为1×105mmol／L 的缬沙坦或1×105mmol／L的PD98059或不加药物,再给予1×107mmol／L的Ang Ⅱ刺激24 h后收集细胞,以无血清培养基 培养的VSMCs作对照。用免疫沉淀法测定ERK活性;用Western-blot方法检测总ERK(total ERK,t-ERK)、磷酸化ERK (phosphorylated-ERK,p-ERK)及丝裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protem kinases phosphatase-1,MKP-1)水 平;用RT-PCR法半定量测定MKP-1 mRNA的含量。结果显示:(1)SHR和WKY大鼠Ang Ⅱ刺激组VSMCs中ERK活 性、p-ERK、MKP-1及MKP-1 mRNA水平均明显高于对照组(P<0．05);SHR和WKY大鼠Ang Ⅱ+缬沙坦组和Ang Ⅱ +PD98059组的上述指标与对照组比较均无显著性差异。(2)SHR大鼠VSMCs中ERK活性、P-ERK、MKP-1及MKP-1 mRNA均显著高于相同干预的WKY大鼠(P<0．01)。(3)SHR和WKY大鼠之间以及对照组、Ang Ⅱ刺激组、Ang Ⅱ+缬沙 坦组和Ang Ⅱ+PD98059组间VSMCs中t-ERK水平均无显著性差异。以上结果表明,Ang Ⅱ可能主要通过其1型(Ang Ⅱ type 1,AT)受体激活SHR和WKY大鼠VSMCs中ERK途径,增加ERK活性和p-ERK蛋白水平,继而引起MKP-1及 MKP-1 mRNA水平升高。     

细胞外信号调节激酶活化在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中的作用

本文旨在探讨细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）在慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）增殖中的作用。建立慢性哮喘大鼠模型,用ERK激动剂表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和抑制剂PD98059干预慢性哮喘大鼠ASMCs的培养。采用流式细胞仪、四甲基偶氮唑盐（MTT）法、^3H-thymidine（TdR）掺入法和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）免疫组织化学法检测ASMCs增殖情况,观察ERK信号通路对ASMCs增殖的影响。RT-PCR和Western blot检测ERK mRNA和ERK1／2、磷酸化ERK1／2（p-ERK1／2）蛋白的表达。与正常对照组ASMCs比较,慢性哮喘组ASMCs的G0/G1期细胞所占比例明显减少,S＋G2／M期细胞所占比例增高;吸光度（A490）值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量均明显增加,ERK mRNA、ERK1／2蛋白、P-ERK1／2蛋白的表达量以及ERK活化率显著增高。经PD98059干预之后,慢性哮喘组ASMCs的S＋G2／M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量明显降低,ERK mRNA、ERK1／2蛋白、p-ERK1／2蛋白的表达量以及ERK活化率显著降低。经EGF干预后,慢性哮喘组ASMCs的S＋G2／M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量和PCNA阳性表达量进一步增高,而这一作用可以被PD98059抑制。以上结果提示,慢性哮喘大鼠ASMCs内源性增殖活性增加,ERK1／2参与其增殖活性的调控,ERK信号通路在哮喘气道重建的ASMCs增殖调控中具有重要作用。     

Role of 15-hydroxyeicosatetraenoic acid in phosphorylation of ERK1/2 and caldesmon in pulmonary arterial smooth muscle cells

We have reported that 15-hydroxyeicosatetraenoic acid (15-HETE) induces pulmonary artery (PA) contraction in rats exposed to hypoxia by activating extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2). In this study, we investigated the characteristics of 15-HETE mediating phosphorylation of ERK1/2 and caldesmon in rat pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs). Our data showed that 15-HETE upregulated ERK1/2 phosphorylation in a dose-dependent manner, which could be blocked by ERK pathway inhibitors U0126 and PD98059. ERK1/2 phosphorylation was attenuated by inhibiting endogenous 15-HETE formation with lipoxygenase inhibitor, cinnamyl 3,4-dihydroxy-[alpha]-cyanocinnamate (CDC), in both normoxic and hypoxic PASMCs. ERK1/2 phosphorylation in response to 15-HETE was detected in cytosol as well as in nucleus and phosphorylatd ERK1/2 partly translocated into nucleus, which could be blocked by PD98059. In addition, caldesmon was phosphorylated in 15-HETE-stimulated cells; this could be inhibited by PD98059. These data demonstrated that 15-HETE is associated with ERK1/2 activation and caldesmon phosphorylation in PASMCs and that 15-HETE is at least partly involved in mediating activation of hypoxia-initiated ERK pathway, possibly leading to hypoxic pulmonary vasoconstriction.     

激活多巴胺I类受体对氧化性低密度脂蛋白诱导的人单核细胞THP-1分泌NO/NOS的影响

目的：探讨激活多巴胺Ⅰ类受体（DR1）对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人单核细胞（THP-1）分泌一氧化氮/一氧化氮合酶（NO/NOS）的影响及可能机制。方法：THP-1细胞经佛波酯PMA诱导分化,分为正常对照组（control）,氧化型低密度脂蛋白处理组（ox-LDL）,DR1激动剂干预组（SKF）,DR1阻断剂干预组（SCH）,ERK阻断剂干预组（PD98059）;应用油红O染色法鉴定泡沫细胞;硝酸还原法检测NO、NOS的变化情况;免疫荧光和Western blot检测各组细胞蛋白表达情况。结果：ox-LDL刺激48 h可形成泡沫细胞;DR1在THP1细胞上表达,ox-LDL刺激后,DR1蛋白表达降低（P<0.01）;激活DR1受体能够明显抑制由ox-LDL引起的NO、iNOS增多（P<0.01）;在MAPK阻断剂PD98059存在的情况下,SKF的作用部分丧失。结论：激活DR1受体可抑制ox-LDL引起的THP-1细胞NO的大量产生,此过程可能由ERK信号通路所介导。     

STAT-1 mediates the stimulatory effect of IL-10 on CD14 expression in human monocytic cells

IL-10, an anti-inflammatory cytokine, has been shown to exhibit stimulatory functions including CD14 up-regulation on human monocytic cells. CD14-mediated signaling following LPS stimulation of monocytic cells results in the synthesis of proinflammatory cytokines. Our results show that LPS-induced CD14 expression on monocytic cells may be mediated by endogenously produced IL-10. To investigate the molecular mechanism by which IL-10 enhances CD14 expression, both human monocytes and the promyelocytic HL-60 cells were used as model systems. IL-10 induced the phosphorylation of PI3K and p42/44 ERK MAPK. By using specific inhibitors for PI3K (LY294002) and ERK MAPKs (PD98059), we demonstrate that LY294002 either alone or in conjunction with PD98059 inhibited IL-10-induced phosphorylation of STAT-1 and consequently CD14 expression. However, IL-10-induced STAT-3 phosphorylation remained unaffected under these conditions. Finally, STAT-1 interfering RNA inhibited IL-10-induced CD14 expression. Taken together, these results suggest that IL-10-induced CD14 up-regulation in human monocytic cells may be mediated by STAT-1 activation through the activation of PI3K either alone or in concert with the ERK MAPK.     

MEK/ERK信号通路对人结膜上皮细胞增殖的影响及其机制研究

目的:探讨MEK/ERK信号通路对人结膜上皮细胞增殖的影响及其可能的机制。方法:采用不同浓度(0、12.5、25、50、100μmol/L)的MEK抑制剂PD98059处理人结膜上皮细胞(HConEpiC),通过CCK-8法检测不同浓度PD98059作用不同时间(0、12、24、48 h)对人结膜上皮细胞增殖的影响,Western blot检测不同浓度PD98059对人结膜上皮细胞ERK1/2、P-ERK1/2表达的影响。结果:相比对照组(0μmol/L),不同浓度(12.5、25、50、100μmol/L)PD98059处理后的人结膜上皮细胞增殖率明显下降,呈剂量-效应关系,且随处理时间增加(12、24、48 h)其抑制作用也显著增强,差异均有统计学意义(P0.05)。不同浓度PD98059处理人结膜上皮细胞24 h后,其ERK及p-ERK1/2表达随处理浓度增加而降低,与对照组(0μmol/L)相比差异有统计学意义(P0.05),且二者表达量与细胞增值抑制率均呈显著负相关(r=-0.995、r=-0.968,P0.05)。结论:PD98059可抑制人结膜上皮细胞增殖,这可能与其下调ERK表达和减少其活化有关。