凝乳酶原（凝乳酶）二硫键Ｃys206—Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Ｃys206-Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为－１６．１kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的ＤＮＡ,采用快退火可解决此矛盾。５个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除Ｃ２０６Ａ外,约占细胞总蛋白的５０％左右,突变的复性结果表明,Ｃys206-Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在５个突变体中,Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ的复性率分别为Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ、Ｃ２１０Ａ、Ｃ２１０Ｓ的４．５倍、２０倍和３０倍,而C206A不能复性。Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ与Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ的远紫外ＣＤ光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加由于上述３个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

凝乳酶原Cys45-Cys50二硫键功能的研究

凝乳酶原突变体Cys45Asp/Cys50Ser包含体溶解所需的温度、时间、pH条件均与野生型一样,而且其氧化再折叠行为与野生型类似,在同样的复性条件下最终都能获得正确折叠可活化的分子.这与缺失Cys250-Cys283二硫键的突变体大不相同,说明Cys45-Cys50二硫键对凝乳酶原正确折叠的贡献小于Cys250-Cys283二硫键,但这对二硫键的缺失使假凝乳酶的热稳定性显著下降,说明此二硫键在稳定酶的空间构象中起重要作用、另外,突变体Cys45Asp/Cys50Ser假凝乳酶的水解蛋白酶活性(P)与凝乳活性(C)均较野生型低,但是其C/P值比野生型高1倍.     

凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析

为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β-转角的功能,利用基因突变技术,将该转角的氨基酸残基(Leu20-Gly21-The22-Pro23-Pro24-Gln25)改为(Leu20-Gly-Gly-Gln25)、(Leu20SerGlyGln25)或(Leu20GlySerGln25),得到3个突变牛凝乳酶原表达质粒Pmcgg,Pmcsg和Pmcgs。除Pmcgs不能在大肠杆菌中表达外,Pmcgg和Pmcsg均能以包含体的形式进行表达,且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样,Pmcgg和Pmcsg的表达产物经过变性复性,均能自活化为假凝乳酶,而且复性后的酶原突变体在DEAESepharose CL6B上的柱行为与野生型相类似,但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小,但对酶的催化效率影响较大。     

凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析

为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β转角的功能,利用基因突变技术,将该转角的氨基酸残基（Ｌｅｕ２０Ｇｌｙ２１Ｔｈｅ２２Ｐｒｏ２３Ｐｒｏ２４Ｇｌｎ２５）改为（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＧｌｙＧｌｎ２５）、（Ｌｅｕ２０ＳｅｒＧｌｙＧｌｎ２５）或（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＳｅｒＧｌｎ２５）,得到３个突变牛凝乳酶原表达质粒ｐＭＣＧＧ,ｐＭＣＳＧ和ｐＭＣＧＳ。除ｐＭＣＧＳ不能在大肠杆菌中表达外,ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ均能以包含体的形式进行表达,且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样,ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ的表达产物经过变性复性,均能自活化为假凝乳酶,而且复性后的酶原突变体在ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ上的柱行为与野生型相类似,但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小,但对酶的催化效率影响较大。     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的表达

以Tac为启动子构建了牛凝乳酶原B基因表达质粒pTaAc,转化大肠杆菌JMl05,对数生长期加入O．1mmo1／L IPTG能明显诱导凝乳酶原的产生。基因表达除受IPTG的影响外,也受温度的调节控制。在30℃培养,IPTG存在时,凝乳酶原产量极低j在42℃无IPTG的条件下,基因也能表达。按电泳扫描计算凝乳酶原蛋白占细胞可溶性总蛋白量的12～19％,按ELISA法测定凝乳酶原产量为80～100mg／L,经变性、复性及酸化有活性的凝乳酶产量为14—20mg/L。     

碱性条件下溶解包涵体提高凝乳酶原复性率的机制

重组凝乳酶原的复性效率不仅依赖于复性条件,而且与包涵体的溶解条件(即变性条件)有关.含有凝乳酶原的包涵体在pH11,8mol/L脲中溶解后,其复性率较在pH8,8mol/L脲中溶解的可提高1倍,由20%左右提高到40%左右.其机制是碱性条件有利于破坏分子间交联的二硫键从而增加凝乳酶原的溶解度.更为重要的是碱性条件使凝乳酶原分子处于一种还原性更强更为伸展的状态,这种状态容易进行正确再折叠.     

NDPK-A C4/109/145 S突变体降低磷酸转移酶活性但增加DNase活性

核苷二磷酸激酶A( nucleoside diphosphate kinase A, NDPK-A）有广泛的生物学活性,在肿瘤转移和调控中起重要作用.单独抑制NDPK-A中任何1个Cys所形成的二硫键,不会降低NDPK-A的磷酸转移酶活性和DNase活性.本实验通过构建C4/109/145S突变体并研究其生物学效应,为NDPK A结构与功能的研究提供参考.用定点突变法将NDPK-A 的4位、109位和145位Cys突变为Ser,构建pBV220-NDPK-A C4/109/145S和pEGFP-NDPK-A C4/109/145S两种重组质粒.在大肠杆菌中高效表达NDPK-A C4/109/145S突变体,纯化后可获得均一的重组NDPK-A C4/109/145S突变体蛋白.HPLC法和DNA消化法测定发现,C4/109/145S突变体磷酸转移酶活性低于野生型NDPK-A,而DNase活性高于野生型NDPK-A.以A549细胞作为模式细胞的流式细胞仪周期检测表明,C4/109/145S突变体与野生型NDPK-A一致,均可将细胞周期延滞在S期和G2/M期.这些结果证实,NDPK A结构异构与其磷酸转移酶活性密切相关,其酶活性至少需要1个Cys残基存在,NDPK-A结构中的二硫键也可能是其DNase活性的负调控机制之一,胞内NDPK-A的氧化还原异构可能对细胞周期无显著影响.     

双峰驼凝乳酶原基因的生物信息学分析

通过生物信息学的方法对双峰驼凝乳酶原基因及相应的氨基酸序列的同源性、理化性质、保守结构域、亚细胞定位、信号肽、跨膜结构域、亲水性/疏水性、二级结构进行预测分析.结果表明,双峰驼凝乳酶原基因开放阅读框全长1 146 bp,编码381个氨基酸,属于胃蛋白酶A超家族,预测定位于内质网（膜）的稳定亲水性蛋白,具有一个16个氨基酸的信号肽,其不含跨膜结构域.无规卷曲是其二级结构中最大量的结构元件,α螺旋和延抻链分散于整个蛋白质中,活性位点的分析表明,编码蛋白有6类活性位点.分析双峰驼凝乳酶原基因及其编码蛋白质的特征,能够为深入开展双峰驼凝乳酶的表达和凝乳特性研究提供理论依据.     

凝乳酶原mRNA的分离及其cDNA克隆的鉴定

用异硫氰酸胍法从牛胃粘膜组织中分离到poly(A)RNA。经电泳分析、体外翻译活性分析及No rIhern转移杂交分析,结果表明,poly(A)RNA中含有完整的,具有生物活性的凝乳酶原mRNA,大小为16S。从poly(A)RNA建立的cDNA库中,以C500-pepsinogen为探针进行初级筛选,集中阳性克隆成为凝乳酶原和相关胃蛋白酶原cDNA富集库。从寓集库中选出插入片段带有凝乳酶原基因所特有的EcoRI切点的19个克隆。经限制性内切酶谱分析确定pcT 5为凝乳酶原基因克隆,其5’端缺少80bP。以pCT 5的插入片段为探针,从cDNA库中进一步筛选得到pCTl5。酶谱分析表明,pcTl5的两端均足以覆盖编码区域,而在917位左右约有110bP的缺失。从而不仅充分证明了分离的poly(A)RNA中含有全链长的凝乳酶原mRNA,而且还可通过拼接pCT5及pCTl5获得完整的凝乳酶原基因。     

人白细胞介素18半胱氨酸的定点突变及其对活性的影响

为研究IL 18结构与功能的关系 ,用重叠延伸PCR定点突变技术构建人白细胞介素 18(hIL 18) 4个半胱氨酸的突变体hIL 18C74 S、C10 4 S、C112 S和C163 S。将突变体的cDNA与原核细胞表达载体pJW2重组并转化大肠杆菌JM10 1。经热诱导后 ,4个突变体在大肠杆菌中均得到了高效表达。表达的蛋白质主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声破碎 ,2mol/L尿素洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,SephadexG 10 0柱纯化后 ,纯度可达 90 %以上。以诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生IFN γ的能力为指标检测复性突变体的活性。结果显示除C10 4 S外 ,其他 3个突变体的生物活性均低于野生型hIL 18,C74 S、C112 S和C163 S的活性分别是野生型hIL 18活性的 5 %、5 8%和11%。证明Cys74 、Cys163 为hIL 18诱导产生IFN γ的功能所必需