刺激面神经核对前包钦格复合体呼吸神经元放电活动的影响及其递质机制

实验选用健康成年SD大鼠,观察电刺激面神经核对前包钦格复合体(pre-—Boetzinger complex,PBC)呼吸神经元(RNs)放电活动的影响,并观察微电泳6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、荷包牡丹碱(BIC)、士的宁(Stry)和阿托品(Atr)对电刺激面神经核引起的PBCRNs放电变化的拮抗效应,以进一步探讨面神经核是否参与呼吸调节及其可能的神经机制。在12只面运动神经元逆行溃变大鼠同侧PBC内共记录到各类RNs116个,电刺激溃变侧面神经核时,前吸气(Pre-I)神经元(24／26个)和吸气(I)神经元(30／35个)主要表现为兴奋,呼气(E)神经元(20／22个)和吸气-呼气(I-E)跨时相神经元(28／33个)表现为抑制。CNQx可完全或部分拮抗电刺激面神经核对Pre-I(18／24)和I(23／27)神经元的兴奋效应;Stry可拮抗电刺激面神经核对Pre-I(12／18)和I(14／23)神经元的瞬时抑制效应以及对I-E(20／28)和E(9／16)神经元的抑制效应;BIC可拮抗电刺激面神经核对I—E(22／25)和E(9／9)神经元的抑制效应;微电泳Atr对各类RNs的放电变化无明显作用。这些结果表明,面神经核非运动神经元可能通过向PBC的纤维投射,以Glu、GABA和Gly为神经递质或调质,调节PBC RNs的活动,从而参与对呼吸运动的调节。     

周围神经损伤后外源性GDNF对神经元的保护作用

采用硅管套接大鼠切断的坐骨神经模型 ,局部给予胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) ,应用尼氏染色、酶组织化学染色方法 ,观察到外源性GDNF能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目 ,降低脊髓前角运动神经元及脊神经节感觉神经元中胆碱酯酶 (CHE)及酸性磷酸酶 (ACP)变化的幅度。这表明外源性GDNF能保护周围神经切断后引起的神经元损伤。     

周围神经损伤后外源性GKNF对神经元的保护作用

采用硅管套接大鼠切断的坐骨神经模型,局部给予胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）,应用尼氏染色、酶组织化学染色方法,观察到外源性ＧＤＮＦ能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目,降低脊髓前角运动神经元及脊神经节感觉神经元中胆碱酯酶（ＣＨＥ）及酸性磷酸酶（ＡＣＰ）变化的幅度。这表明外源性ＧＤＮＦ能保护周围神经切断后引起的神经元损伤．     

人源性神经营养素-6对体外培养海马神经元存活的促进作用

分离出一周SD乳鼠海马组织,进行离体海马细胞培养;在培养基中加入神经营养素-6成熟肽片段,通过神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色,计数存活海马神经元数量,与对照组比较,观察神经营养素-6对神经元存活的促进作用。结果显示,神经营养素-6实验组海马神经元存活数目显著高于对照组。表明人源性神经营养素-6可以促进体外培养神经元的存活。     

Cathepsin L与MMP-3在兔椎间盘退变中相关性研究

目的:探讨组织蛋白醇L(Cathepsin L)与基质金属蛋白酶-3(MMP-3)在兔椎间盘退变中的相关性.方法:健康大白兔60只随机分为实验组、阴性对照组、空白对照组,实验组分为三个亚组,椎间盘内注射3种不同浓度的Cathepsin L,阴性对照组中在椎间盘内注射生理盐水,空白对照组不做任何处理.采用HE粢色组织学观察椎间盘的退变特征,免疫组织化学S-P法检测椎间盘组织中MMP-3的表达.结果:HE染色组织学观察6周时在实验组椎间盘中,组织学观察到不同程度的椎间盘退变特征:□核脊索细胞逐渐减少,并逐渐被纤维软骨组织替代,纤维环与髓核之间失去明显的界限.免疫组织化学染色结果,3周、6周时实验组MMP-3的阳性率均高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.05).结论:Cathepsin L与MMP-3共同参与了兔椎间盘的退变,Cathepsin L可能促进MMP-3在椎间盘内的生成,从而导致椎间盘的退变.     

大鼠脊髓挤压伤后NT-3、NT-4在腹角运动神经元表达的变化

我们前面的研究已证实,神经生长因子和脑源性神经营养因子与成年大鼠挤压性脊髓损伤修复有关。在本研究中,通过免疫组织化学ABC法,我们探讨了挤压伤后不同时间脊髓腹角神经元NT-3和NT-4的表达。结果显示,在对照组,NT-3和NT-4的阳性反应主要分布在脊髓腹角神经元,挤压性脊髓损伤后7天和21天,NT-3阳性神经元的数量较对照组和24小时组明显增加,比较之,损伤后24小时和7天,NT-4阳性神经元的数量已较正常者增多,且NT-T的反应强度21天者较24小时和7天者有增多。结果表明NT-3和NT-4的表达在挤压性损伤后的脊髓腹角神经元被不同程度地上调,提示NT-3和NT-4可能与挤压性脊髓损伤修复有关。     

重复使用氯胺酮对成年猫视皮层神经元凋亡和BDNF表达的影响

目的研究重复使用氯胺酮麻醉剂对成年猫视皮层神经元存活和脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响。方法用盐酸氯胺酮对成年猫实施重复麻醉2m,每3d麻醉1次。用尼氏染色显示视皮层神经元,TUNEL-原位杂交试剂盒检测凋亡细胞,免疫组织化学ABC法标记BDNF免疫阳性神经元。光镜下观察、拍照,并用Image-Pro Express 6.0分析软件进行细胞密度统计和免疫反应光密度值测量。结果与正常对照组猫相比,实验组猫视皮层神经元数量没有显著差异(P0.05),但TUNEL阳性反应的平均光密度(IOD)值显著升高(P0.01),同时BDNF免疫阳性细胞显著增多,且BDNF免疫反应的IOD值显著增大(P0.01)。结论重复使用氯胺酮麻醉会启动成年猫视皮层神经元的程序性凋亡进程,同时会增加神经营养因子的分泌,这可能对凋亡中的神经元起保护作用。     

吗啡依赖小鼠前脑皮质神经元神经营养因子-3的表达

目的:探讨吗啡依赖小鼠前脑皮质神经元神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的表达.方法:采用免疫组织化学法显示吗啡依赖小鼠前脑皮质神经元NT-3的表达.结果:吗啡依赖组和纳洛酮诱发戒断组小鼠前脑皮质NT-3密度均明显增加(P＜0 01).结论:NT-3参与了吗啡依赖对前脑皮质神经元损害的保护作用.     

GDNF对体外运动神经元和感觉神经元的影响

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对正常胎鼠脊髓运动神经元(SMN)和背根神经节神经元(DRG)生长活性的作用.方法:建立大鼠胚胎SMN和DRG单细胞培养体系,观察1 μg/L、10 μg/L、50 μg/L和100 μg/L GDNF对SMN和DRG存活及突起生长的影响.结果: GDNF组培养的SMN和DRG存活数目明显增加,神经元突起长度比对照组明显增长,且具有剂量依赖趋势.结论: GDNF对正常大鼠胚胎发育期运动神经元和感觉神经元具有神经营养作用.     

T10对LPS诱导脑内炎症反应中血脑屏障的保护作用

目的:研究雷公藤甲素对内毒素诱导的脑内炎症中血脑屏障通透性,神经细胞的保护作用.方法:选用健康成年雄性SD大鼠,随机分为雷公藤甲素处理组(T10+LPS组),内毒素组(LPS组),生理盐水组(NS组),每组6只动物常规Nissl染色、GFAP免疫组化染色和伊文思蓝(EB)荧光示踪法.结果:尼氏染色显示NS组海马CA1区锥体神经元排列规则整齐.LPS组的神经元细胞的密度和层次较NS组和T10+LPS组少,且锥体神经元数目减少,排列散乱,细胞间距加大,神经元有明显的丢失;GFAP免疫组化染色结果显示,NS组海马CA1区GFAP免疫阳性细胞分布稀疏,胞体较小,突起细长,染色较浅.LPS组较T10+LPS组星形胶质细胞密集,胞体和突起大,染色深;伊文思蓝荧光示踪结果,LPS组的大脑皮质与海马结构以及脑血管周围的EB荧光强度都明显强于T10+LPS组和NS组;T10+LPS组与NS组EB荧光强度无差别.结论:T10在LPS诱导的神经炎症中对神经元有保护作用,其机制可能与保护BBB有关.     

针刺对去卵巢大鼠脑内胆碱乙酰转移酶基因表达的影响

本工作旨在探讨雌激素对脑内乙酰胆碱生成的影响和电针刺激“足三里”穴对去卵巢大鼠脑内乙酰胆碱生成的调整作用。实验选用成年Wistar雌性大鼠,将动物分为正常对照组(INT)、去卵巢组(OVX)和去卵巢针刺组(OVX AC)。用放射免疫分析方法测定血中雌二醇含量,采用RT-PCR方法获得大鼠脑内胆碱乙酰转移酶(ChAT)mRNA的逆转录表达产物——cDNA,用琼脂糖凝胶电泳方法检测,并通过原位杂交方法观察海马ChAT mRNA阳性神经元的表达,然后用计算机图像分析系统进行统计分析。实验结果显示：去卵巢组大鼠体内雌激素水平明显降低,脑内ChAT mRNA的RT-PCR产物和海马ChAT mRNA阳性表达产物的平均面积、平均积分光度值均明显减少,与对照组和针刺组比较有显著性差异;去卵巢针刺“足三里”穴组与去卵巢组相比,大鼠血中雌激素水平明显升高,脑内ChAT mRNA RT-PCR产物明显增多,海马的ChAT mRNA表达阳性神经元增多。以上结果提示：脑内ChAT基因表达与体内雌激素水平有密切关系,去卵巢后针刺“足三里”穴对ChAT的调节作用可能是针刺增强脑内乙酰胆碱含量的机制之一。     

L-NAME对大鼠急性脊髓损伤的影响

实验采用雌性Wistar大鼠15只,分为正常对照组、生理盐水对照组L－NAME治疗组,后两组制成急性脊髓损伤模型,于术后每天一次腹腔注射L－NAME（20kg/kg）或等量生理盐水,连续七天,然后处死动物,行脊髓NOS和Nissl染色。结果显示,L－NAME治疗组脊髓NOS阳性神经元染色较生理盐水对照组浅,组间光密度比较P＜0.05。此外,生理盐水对照组脊髓神经元还出现尼氏体位、减少,甚至消失等现象;这些改变在L－NAME治疗组较轻,因此我们认为,大鼠急性脊髓损伤可诱导神经元NOS表达,L－NAME可对其损伤修复起促进作用。     

慢性间断性低氧大鼠认知功能和脑胆碱能神经元的进行性变化

目的：探讨慢性间断性低氧（CIH）大鼠认知功能的进行性变化及其与脑胆碱能神经元变化的关系。方法：成年雄性SD大鼠40只,随机均分为对照组、慢性间断性低氧1,3,5周组。应用Morris水迷宫检测认知功能的变化;利用HE染色在光镜下计数前额叶皮层和海马坏死神经元数;利用免疫组化方法检测前额叶皮层和海马胆碱乙酰转移酶（ChAT）阳性表达。结果：CIH各组大鼠学习记忆能力呈进行性下降趋势;与对照组比较,CIH5w组出现明显学习记忆功能障碍（P〈0.05）。CIH各组前额叶皮层和海马变性坏死神经元数增多,且随低氧时间延长,上述改变呈慢性进行性加重趋势。CIH各组前额叶皮层和海马ChAT阳性表达逐渐下降;与对照组比较,CIH3w组和CIH5w组前额叶皮层和海马ChAT阳性表达明显减少,差异具有显著性（P〈0.05）。结论：慢性间断性低氧大鼠认知功能进行性下降与前额叶皮层和海马神经元病理性损伤、ChAT表达进行性减少有关。     

米诺环素对不完全脊髓损伤大鼠脊髓BDNF和NT-3表达的影响

目的观察腹腔注射米诺环素对改良Allen’s法造成的不完全脊髓损伤大鼠脊髓中脑源性神经营养因子以及神经营养因子3表达的影响,探讨米诺环素治疗脊髓损伤的作用机制。方法成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠54只,改良Allen’s法造成不完全脊髓损伤,根据实验需要可以分为3组,空白组,只打开脊柱椎板,不损伤;治疗组,大鼠脊髓损伤,并腹腔注射米诺环素;损伤组,大鼠脊髓损伤,腹腔注射等剂量的生理盐水。观察各组大鼠的后肢能力Basso-Beattie-Bresnahan评分,并于不同时段(3d、7d,14d)取大鼠脊髓T8-9段采用逆转录PCR,以及免疫化学组织染色法测定脑源性神经营养因子以及神经营养因子3的表达。结果米诺环素能够明显改善不完全脊髓损伤大鼠的功能,逆转录PCR和脊髓组织冰冻切片免疫组织化学染色DAB都能证实米诺环素治疗组脑源性神经营养因子以及神经营养因子3表达显著增多。结论米诺环素在治疗不完全脊髓损伤大鼠的机制还应与其上调了大鼠体内的脑源性神经营养因子以及神经营养因子3表达有关。     

黄芪甲甙对实验性肺纤维化大鼠Cathepsin B表达的影响

目的:探讨黄芪甲甙时实验性肺纤维化大鼠肺组织中组织蛋白酶B(Cathepsin B,CB)表达的影响。方法:36只SD大鼠,随机分为对照组、模型组和干预组。模型组和干预组气管内注射博来霉素(BLM,5mg/kg)诱导肺纤维化,对照组在相同条件下给予生理盐水。第二天起干预组大鼠每天经胃管灌服0．1g/L黄芪甲甙2ml,其余两组相同条件下给予助溶剂羧甲基纤维素钠。治疗的第7d和28d,处死动物取出肺组织,进行病理学观察;测定28d肺组织中羟脯氨酸含量;用免疫组化和RT-PCR观察各组鼠肺组织CB蛋白及mRNA表达的水平。结果:病理学观察显示:与模型组比较,干预组肺泡炎和纤维化程度均减轻;模型组羟脯氨酸含量显著增高,而干预组与模型组比较羟脯氨酸含量明显降低;与模型组比较,干预组CB蛋白及mRNA表达显著降低。结论:黄芪甲甙可能通过押制CB的过度表达,对实验性大鼠肺纤维化具有良好的治疗作用。     

茵陈蒿汤加减方对哮喘大鼠模型气道TGF-beta1 的干预作用

目的:探讨茵陈蒿汤加减方对哮喘气道转化生长因子-β1(TGF-β1)的干预机制。方法:制备大鼠哮喘模型,模型动物随机分为四个组:模型组、西药(地塞米松)组、中药组,空白对照组,每组10只大鼠。从第17天起开始给予相应药液灌胃,西药组给予地塞米松1 g/kg,中药组给予茵陈蒿汤加减方配方颗粒溶液(浓度0.5 g/m L)5 m L/kg,每日1次。空白对照组和模型组分别以等量的生理盐水灌胃,每周按照大鼠体重调整1次。连续给药干预4周,检测血清中TGF-β1含量并进行比较分析。结果:中药组与西药组均可降低TGF-β1的含量,与模型组比较有显著性差异(P<0.01),中药组与西药组效果相当(P>0.05)。结论:茵陈蒿汤加减方能通过有效地减低大鼠血清中TGF-β1的含量,从而阻断气道重塑的发生,达到预防和缓解哮喘的治疗目的。     

逆转录病毒介导的人NT—3在嗅神经鞘细胞中的表达及活性检测

本文构建了pRev-TRE-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Ecopack293细胞将其与pRevTet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠神经嗅神经鞘细胞（olfctory ensheathing cells,OECs),并经强力霉素（Dox）诱导,获得Dox浓度依赖性hNT-3表达的OECs,最后经过Western-Blot检测hNT-3的表达以及通过DRG与NT－3转染后OECs联合培养来对表达的hNT-3活性进行鉴定,结果：（1）hNT-3－pcDNA的多克隆位点,用EcoRI和HindⅢ酶切,PCR扩增,再用Sall和Hind Ⅲ切下全长编码的hNT-3cDNA,定向连接到pRev-TRE上,pRev-TRE全长为6．5kb,NT-3全长为0.78kb,pRev-TRE-NT-3重组体经过鉴定,确认插入子的方向和完整性,结果与预期相符。（2）hNT-3修饰的OECs培养上清经Western-blot检测,与hNT-3抗体结合的蛋白条带分子量约为28kd,hNT-3修饰过的OECs上清表达量明显高于未转染组OECs的表达量,且hNT-3表达量与Dox浓度有依赖性。（3）与hNT-3修饰的OECs联合培养背根神经节（dorsal root ganglion,DRG),有许多DRG细胞向外迁移,这些细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。而未修饰的OECs组, 只有少量的细胞迁移生长,细胞迁移和突起生长都很局限,空白对照组的DRG没有向外迁移的细胞和向外延伸的突起;且对照组的突起生长长度明显比NT－3修饰的实验组短（P＜0．01）。这些结果表明,Tet-On调控NT－3表达在OECs转染成功,为进一步体内移植修复损伤提供了理想的材料。     

miR-506与PI3K/AKT通路在自发性高血压大鼠心脏重构中的作用

目的:探讨mi R-506和PI3K/AKT信号通路在自发性高血压大鼠心脏重构中的作用。方法:将12只雄性自发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertension Rat, SHR)随机分为2组,每组6只。分别为SHR模型组和治疗组(卡托普利,30 mg·kg~(-1)),6只健康WKY大鼠作为空白对照组。SHR模型组和空白对照组灌胃等体积生理盐水,连续给药8周,采用尾动脉测压法测定给药前后各组大鼠血压,采用qRT-PCR法检测各组大鼠心肌miR-506表达量,并检测大鼠心肌组织中SOD和GPx mRNA表达水平,免疫印迹检测大鼠心肌中p-PI3K和p-AKT的蛋白表达量。结果:SHR模型组血压为(184.79±3.35)mmHg,与空白对照组比较显著升高(P0.05),治疗组血压为(133.57±1.43)mm Hg,与SHR模型组相比均显著降低(P0.05)。SHR模型组大鼠心肌中mi R-506、SOD、GPx的RNA相对表达量分别为(0.36±0.05)、(0.27±0.04)和(0.32±0.02),与空白对照组比较显著降低(P0.05),而p-PI3K、p-AKT蛋白水平显著降低(P0.05),与SHR模型组比较,治疗组大鼠心肌中mi R-506以及SOD、GPx的RNA水平显著升高(P0.05),p-PI3K、p-AKT蛋白水平显著升高(P0.05)。结论:在卡托普利治疗高血压的过程中,mi R-506可能通过抑制PI3K/AKT信号通路提高机体的抗氧化能力促进SHR心脏重塑。     

逆转录病毒介导的人NT-3在嗅神经鞘细胞中的表达及活性检测

本文构建了pRev-TRF-NT-3的逆转录病毒表达载体,通过Fcopack293细胞将其与pRev-Tet-On分别进行包装,制备了重组缺陷型的hNT-3和Tet-on逆转录病毒,用这两种病毒感染原代培养大鼠嗅神经鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并经强力霉素(Dox)诱导,获得Dox浓度依赖性hNT-3表达的OECs,最后经过Western-Blot检测hNT-3的表达以及通过DRG与NT-3转染后OECs联合培养来对表达的hNT-3活性进行鉴定,结果:(1)hNT-3-pcDNA的多克隆位点,用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,PCR扩增,再用Sall和Hind Ⅲ切下全长编码的hNT-3 cDNA,定向连接到pRev-TRF上,pRev-TRF全长为6.5kb,NT-3全长为0.78kb,pRev-TRE-NT-3重组体经过鉴定,确认插入子的方向和完整性,结果与预期相符。(2)hNT-3修饰的OECs培养上清经Western-blot检测,与hNT-3抗体结合的蛋白条带分子量约为28kd,hNT-3修饰过的OECs上清表达量明显高于未转染组OECs的表达量,且hNT-3表达量与Dox浓度有依赖性。(3)与hNT-3修饰的OECs联合培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG),有许多DRG细胞向外迁移,这些细胞折光性强,突起较长而纤细,并形成复杂的网络。而未修饰的OECs组,只有少量的细胞迁移生长,细胞迁移和突起生长都很局限,空白对照组的DRG没有向外迁移的细胞和向外延伸的突起;且对照组的突起生长长度明显比NT-3修饰的实验组短(P<0.01)。这些结果表明,Tet-On调控NT-3表达在OECs转染成功,为进一步体内移植修复损伤提供了理想的材料。