人精子抗原决定簇的末端单糖参与小鼠IgA单抗与抗原的结合

研究消化道免疫后获得的抗人精子单抗(特别是IgA单抗)的靶抗原分子性质,有助于了解哪一些抗原可以通过消化道免疫,刺激机体产生局部分泌性兔疫反应。这对于抗精子避孕疫苗研制中精子有效抗原和免疫避孕投药途径的选择,阐明精子局部免疫的发生机制和弄清免疫性不育病人的病因有一定的意义。本文对消化道免疫获得的33个抗精子IgA单抗,12个IgG和35个IgM单抗靶抗原的生化性质及末端单糖做了鉴定。免疫印迹的结果显示,IgA,IgM和IgG类单抗靶抗原的分子量范围分别为10—89,11—75和12—94 KDa。有12个单抗的靶抗原为非蛋白类的糖复合物,一个IgA单抗(A 22)的靶抗原为不含糖的蛋白。凝集素封闭和糖苷酶消化试验的结果显示,98.7%单抗的靶抗原分子末端含一种或几种糖。五种凝集素对IgA类单抗靶抗原的封闭效应均较强,表明IgA类单抗靶抗原的抗原决定簇含有岩藻糖,乙酰氨基葡萄糖,乙酰氨基半乳精,半乳糖和甘露糖等末端单糖者较多。IgG类单抗靶抗原的抗原决定簇则含有带岩藻糖,乙酰氨基半乳糖和α-甘露糖等末端单糖者较多。内切-β-半乳糖苷酶消化试验的结果表明,54.4%IgA类单抗的靶抗原为依赖半乳糖苷连接的糖肽化合物。这些结果表明,经消化道免疫能产生IgA及其它类别抗体的绝大多数人精子抗原为含多种类型末端单糖的膜表面分子。     

以人精子抗原消化道免疫后的体液免疫反应

The inbred Balb/c and C57 mice, and the outbred Swiss Webster mice were intragastrointestinally immunized with human sperm antigens. The lymphocytes from the spleen, mesenteric lymph node (MLN), Peyer's patch (PP) and uterus or epididymis were isolated and cultured. The lymphocyte-secreting antisperm IgG and IgA and the antisperm antibodies in the gut wash and serum were determined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In the Balb/c and Swiss Webster mice, the immune responses to sperm have shown to be stronger than that in C57, stronger in female than in male. The antigenicity of sperm membrane extracts seems to be higher than that of whole sperm. Antisperm antibodies secreted by lymphocytes from the epididymis and uterus have demonstrated to be detectable. For stimulation of the local immune response, the intra-PP and intralumina immunizations are more effective than others.     

以人精子抗原消化道免疫后的体液免疫反应

在Balb/c、C57和昆明鼠的消化道不同部位以人精子抗原免疫后,取其脾、肠系膜淋巴结、Peyer氏淋巴小结及子宫或附睾中的淋巴细胞进行培养。以ELISA法测定了这些部位的淋巴细胞所分泌的以及免疫小鼠肠道冲洗液和血清中的抗精子抗体。结果提示,Balb/c和昆明鼠抗精子免疫反应较强,而且雌性强于雄性。免疫部位以小肠及Peyer氏淋巴小结内注射的免疫效果较好,不仅可引起消化道局部免疫反应,而且子宫、附睾等生殖道组织也有淋巴细胞分泌抗精子抗体。     

与顶体反应相关的抗人精子单克隆抗体及其抗原的特性 Ⅰ顶体反应的诱导及抗顶体反应精子的单克隆抗体的制备

精子必须经过获能和顶体反应(AR)才具受精能力。利用获能和AR 前后精子细胞内和精子表面大分子的变化,可探索新的避孕办法和男性不育诊断及治疗的新途径。本文将正常人精子于体外在BWW-BSA 培养基中获能,用钙离子载体A 23187诱导人精子进行AR(以三重染色和金霉素荧光染色两种方法检测这些精子的AR 率为50%左右),然后用这些新鲜的人精子作为免疫原,制备了23个抗人精子单克隆抗体,其中21个为IgM,2个分别为IgG_1和IgG_2。根据23个单克隆抗体与经获能和AR 处理的精子以及未处理精子的不同免疫反应,将它们分为A(AR 精子反应组)、B(未处理精子反应组)和C(双重精子反应组)三组,并测定了这些单克隆抗体与人的某些白血病细胞系的交叉反应。     

与顶体反应相关的抗人精子单克隆抗体及其抗原的特性 Ⅱ单克隆抗体对精子功能的影响以及抗原定位与免疫印迹

精子只有经过获能和顶体反应,才能与卵融合。本文对以体外诱导的顶体反应人精子作为免疫原制备的23个单克隆抗体进行了一系列鉴定,结果表明:所得单克隆抗体的间接免疫荧光染色,主要定位在人精子的赤道板和中段,没有发现定位于顶体及顶体后的单克隆抗体。某些单克隆抗体的间接免疫荧光染色部位在顶体反应后发生了改变。有18个单克隆抗体显示程度不同的精子凝集作用,未发现有精子制动作用的单克隆抗体。免疫印迹证实,有9个单克隆抗体的靶抗原是蛋白质类物质。     

重组人睾丸精子结合蛋白对人精子蛋白激酶A及蛋白激酶C活性的影响

为探讨人睾丸精子结合蛋白(human testis sperm binding protein,hTSBP)促进人精子获能的分子机制,检测了重组hTSBP对人精子蛋白激酶A(PICA)和蛋白激酶C(PKC)活性的影响.用重组载体pcDNA3.1/myc-His(-)B-tsbp转染真核细胞后,金属亲和层析纯化表达的重组蛋白质His6-TSBP;重组蛋白质处理健康成人精子后,分别提取精子胞浆及胞膜蛋白组分,发现重组蛋白质可以与精子胞膜结合;经放射自显影检测,发现0.1 mg/ml重组蛋白质可以提高人精子中PKA的活性,对精子膜PKC活性无显著影响.     

鼠冠状病毒核衣壳蛋白的抗体制备与抗原决定簇分析

核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白有稳定病毒基因组、调控病毒复制及细胞状态的特殊作用。鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus,MHV)为乙型冠状病毒属的原型病毒,是研究冠状病毒N蛋白功能的经典模型。本研究用去污剂处理鼠冠状病毒粒子暴露N蛋白,另用原核表达纯化的重组N蛋白分别免疫小鼠,制备多克隆及单克隆抗体。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白免疫印迹分析结果显示两类抗体均具有高灵敏度和特异度,与甲型冠状病毒猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的N蛋白无交叉反应。原核表达缺失突变的N蛋白分析结果显示,多克隆抗体与单克隆抗体2E6识别的鼠冠状病毒N蛋白抗原决定簇完全一致,位于N端结构域(N-terminal domain,NTD)C端与SR之间的58个氨基酸残基内。此外,基于单克隆抗体2E6的ELISA及免疫荧光法能检测到感染细胞中和培养上清液中的N蛋白组分,且其含量与病毒复制的滴度一致。这些结果表明,鼠冠状病毒复制过程中粒子与细胞中的N蛋白可能维持相似的结构,使NTD与SR之间的部分氨基酸残基一直暴露在表面,从而形成了优势抗原决定簇。     

小鼠精子睾丸后成熟过程中单克隆抗体MSH27抗原表位的显露

MSH2 7是一株抗小鼠精子的单克隆抗体 ,此抗体及其纯化的抗原分子在体外受精实验中均可以阻止精卵膜融合 ,因而推测其抗原在精卵膜融合过程中具有重要的作用 .这里探讨了抗原分子在精子睾丸后成熟过程中MSH2 7识别表位的显露条件 .MSH2 7抗原分子在睾丸中产生 ,定位于精子顶体后区的质膜上 ;但MSH2 7所识别的抗原表位只在顶体反应后的精子上表露 .在受精过程中 ,精子必须完成顶体反应并穿过卵子的透明带才能接近卵子质膜并与之融合 .同时还研究了顶体反应和穿透明带作用对MSH2 7表位显露的影响 .在附睾成熟过程中 ,随着精子在附睾中的转运 ,它们发生顶体反应的能力不断增加 ;精子抗原表位的显露呈现顶体反应依赖性 ,且两者呈现线性回归关系 .钙离子载体A2 3 187诱发顶体反应后 ,MSH2 7染色阳性的精子远远少于顶体反应的精子 ;但穿过透明带后绝大多数精子 ( 98% )呈现MSH2 7染色阳性 .总之 ,在睾丸后成熟 (附睾成熟、获能、顶体反应 )和精子穿透明带的过程中 ,对整个精子群体来讲 ,单抗MSH2 7所识别的抗原表位的显露和精子最终获得穿入卵子质膜的能力是同步发生的 .     

结核杆菌抗原85A与小鼠白细胞介素21共表达DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

目的:利用真核表达质粒pRSC,构建结核杆菌抗原85A(Ag85A)与小鼠白细胞介素21(mIL21)共表达重组体pRSC-mIL21-Ag85A,为研究新型结核杆菌DNA疫苗提供新的策略。方法:从质粒pcDNA3.1-mIL21中经PCR扩增出mIL21基因,并插入质粒pRSC中构成pRSC-mIL21;再从pIRES-Ag85A质粒中经PCR扩增出Ag85A基因,构建于pRSC-mIL21重组质粒上,成为共表达DNA疫苗pRSC-mIL21-Ag85A。结果:经酶切、基因测序证实,该疫苗构建正确并能成功表达目的基因。共表达DNA疫苗免疫小鼠后,CTL活性、特异性淋巴细胞增殖水平及小鼠血清特异性抗体均呈有意义的提高。结论:结核杆菌Ag85A与mIL21共表达DNA疫苗能诱导小鼠免疫反应,为进一步研究DNA疫苗抗结核杆菌攻击的免疫防护效应奠定了基础。     

S抗原与抗体结合的扫描隧道显微镜研究

用扫描隧道显微镜观察了兔Ｓ抗原及其与鼠抗兔Ｓ抗原抗体相互作用所形成的复合物,结果表明,Ｓ抗原单体呈椭球状。其二维尺寸为７．５ｎｍ×５．３ｎｍ,且常以二聚体形式存在。抗原分别结合于抗体的二个Ｆａｂ段,既可以单体结合,也可以二聚体形式结合。     

小鼠精子表面SBA结合糖复合物的形成与变化

用ＨＲＰ标记的大豆凝集素（ＳＢＡ）对睾丸与附睾切片,以及取自附睾和子宫（交配后）内的精子进行了标记,旨在认识精子在发生、成熟和获能过程中表面糖复合物的形成与变化规律。在睾丸内,精母细胞和早期精子细胞胞质内有一强阳性颗粒,处于精子形成期的精子细胞呈弱阳性标记。附睾管内的精子团呈强阳性,附睾管上皮则仅在游离缘呈弱阳性。交配后１．５小时自子宫内洗出的精子,其顶体区的标记增至强阳性,但随着在子宫内存留时间的延长,标记强度逐渐减弱或消失。结果表明,１）精子表面的ＳＢＡ结合糖复合物出现于精子形成期;２）在成熟和获能过程中精子表面的ＳＢＡ结合糖复合物发生明显的变化     

抗小鼠精子特有乳酸脱氢酶C4的与分泌片装配或未装单克隆抗体IgA的…

为了测定抗精子ＩｇＡ在免疫不育和抗精子避孕疫苗研制方面的生物学作用,用肠道内免疫的方法制备了一组抗乳酸脱氢酶Ｃ４（ＬＤＨ－Ｃ４０的单克隆ＩｇＡ抗体（ｍｏＩｇＡ）。以免疫印迹证实了它们的异质同形体。大部分ｍｏＩｇＡ（ＰＡ１－ＰＡ５）是用肠道内免疫和以派依尔氏淋巴细胞作为亲本细胞进行融合来获得的。在豚鼠血清补体存在的情况下,小鼠精子可以被ｍｏＩｇＡＰＡ１,ＰＡ２和ＰＡ４所制。高浓度ＰＡ４和ＰＡ５可凝集     

小鼠精子表面Con A结合糖复合物的形成与变化

用辣根过氧化物酶标记的ＣｏｎＡ（伴刀豆素Ａ）对小鼠睾丸与附睾切片,以及对取自附睾和子宫（交配后）内的精子涂片进行了标记,旨在认识精子在发生、成熟和获能过程中表面糖复合物的形成与变化。本研究表明,睾丸内的生精细胞和支持细胞均呈ＣｏｎＡ标记阳性。附睾的输出小管和附睾管上皮细胞,ＣｏｎＡ标记呈中度至强阳性,有部位的差别。附睾头和附睾尾内精子表面的标记无明显差别,标记位置均主要在顶体区和尾部。精子在子宫内存留１．５小时后,顶体后区出现中度阳性标记,但存留３小时和６小时后,顶体和顶体后区的标记均减弱或消失。这些结果提示,（１）精子发生期即可合成ＣｏｎＡ结合糖复合物,（２）精子在附睾成熟过程中表面的ＣｏｎＡ结合糖复合物无明显变化,（３）精子获能后顶体后区出现的ＣｏｎＡ结合糖复合物可能与受精能力有关。     

抗小鼠精子特有乳酸脱氢酶C4的与分泌片装配或未装单克隆抗体IgA的生物学功能

为了测定抗精子IgA在免疫不育和抗精子避孕疫苗研制方面的生物学作用,用肠道内免疫的方法制备了一组抗乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)的单克隆IgA抗体(moIgA)。以免疫印迹证实了它们的异质同形体。大部分moIgA(PA1-PA5)是用肠道内免疫和以派依尔氏淋巴细胞作为亲本细胞进行融合来获得的。在豚鼠血清补体存在的情况下,小鼠精子可以被moIgA PA1、PA2和PA4所制动。高浓度PA4和PA5可凝集小鼠精子。小鼠体外受精率可被3个moIgA(PA2、PA3和PA4)显著降低,但用PA1、PA2和PA5被动免疫之后,小鼠体内受精无明显变化。纯化的小鼠胆汁分泌片可同纯化的moIgA或腹水中的moIgA在体外组装起来。同分泌片结合之后,moIgA对精子的制动、凝集和体外受精无明显变化。这些研究结果提供了抗LDH-C4的moIgA和分泌性IgA对精子功能和体外受精的生物学作用的直接证据,在免疫不育的防治,避孕疫苗的研制以及性传播疾病的防治方面均有一定的指导意义。     

抗小鼠精子特有乳酸脱氢酶C4的与分泌片装配或未装配的单克隆抗体IgA的生物学功能

为了测定抗精子ＩｇＡ在免疫不育和抗精子避孕疫苗研制方面的生物学作用,用肠道内免疫的方法制备了一组抗乳酸脱氢酶Ｃ４（ＬＤＨ－Ｃ４）的单克隆ＩｇＡ抗体（ｍｏＩｇＡ）。以免疫印迹证实了它们的异质同形体。大部分ｍｏＩｇＡ（ＰＡ１－ＰＡ５）是用肠道内免疫和以派依尔氏淋巴细胞作为亲本细胞进行融合来获得的。在豚鼠血清补体存在的情况下,小鼠精子可以被ｍｏＩｇＡＰＡ１、ＰＡ２和ＰＡ４所制动。高浓度ＰＡ４和ＰＡ５可凝集小鼠精子。小鼠体外受精率可被３个ｍｏＩｇＡ（ＰＡ２、ＰＡ３和ＰＡ４）显著降低,但用ＰＡ１、ＰＡ２和ＰＡ５被动免疫之后,小鼠体内受精无明显变化。纯化的小鼠胆汁分泌片可同纯化的ｍｏＩｇＡ或腹水中的ｍｏＩｇＡ在体外组装起来。同分泌片结合之后,ｍｏＩｇＡ对精子的制动、凝集和体外受精无明显变化。这些研究结果提供了抗ＬＤＨ－Ｃ４的ｍｏＩｇＡ和分泌性ＩｇＡ对精子功能和体外受精的生物学作用的直接证据,在免疫不育的防治,避孕疫苗的研制以及性传播疾病的防治方面均有一定的指导意义。