酵母表达肌肉生长抑制素前肽发酵工艺的优化

突变型肌肉生长抑制素前肽（MMP）在治疗肌肉萎缩症和培育多肌肉牲畜上有着广泛的应用前景。以重组表达MMP的毕赤酵母工程菌为模式,对该工程菌在30L发酵灌中培养与诱导备件进行优化,建立该表达系统大规模发酵的最佳生产条件,以期荻得最短的发酵时间和最低的生产损耗。毕赤酵母发酵过程通常分为3个阶段：分批培养（基础培养）阶段、分批补料培养阶段、诱导阶段。对发酵过程的第2与第3阶段进行了优化。通过分步提高甘油流加速度：以20mL／L·h^-1的速度流加5h、以30mL／L·h^-1的速度流加5h、以50mL／L·h^-1速度流加14h,并通入纯氧气,维持60％的溶氧度,使甘油流加阶段的时间从常规的48h缩短至24h,即只需24h即可达到常规方法48h才能达到的菌体密度。在诱导表达阶段,通过甘油与甲醇的交替流加,同时对发酵液中甲醇含量的实时监测,保持甲醇的浓度不超过0．5％的高限,使诱导的时间从常规的72h缩短至36h,而且表达量提高了约1倍。优化后,整个发酵周期从120～148h缩短至72～80h,显著提高了MMP蛋白的生产效率。     

玉米浆对玉米粉和木薯淀粉发酵甘油的影响及二者的比较

以玉米粉和木薯淀粉为原料 ,比较了二者的液化和糖化 ,结果表明 :在相同条件下 ,木薯淀粉液化时间较短 ,玉米粉液化时间较长 ,但二者的液化液均较易糖化。然后分别以玉米粉和木薯淀粉糖化液为原料 ,用耐高渗酵母发酵生产甘油 ,研究了玉米浆对二者甘油发酵的影响并对二者进行了比较 ,结果表明 :当玉米粉和木薯淀粉糖化液还原糖含量分别为 2 5 % ,尿素为 0 .2 % ,pH为 4 .5时 ,用玉米粉糖化液发酵甘油时可不添加玉米浆 ,甘油产量最高可达 2 % ,而用木薯淀粉糖化液发酵甘油时 ,适宜的玉米浆为 0 .15 % ,甘油产量最高可达 4 .9%。对二者的比较结果表明 :用玉米粉糖化液为发酵原料时 ,发酵时间较短 ,残糖降低较快 ,甘油产量较低 ,在 36h之后 ,甘油开始反耗。而用木薯淀粉糖化液发酵时 ,发酵时间较长 ,残糖降低较慢 ,甘油产量较高 ,在 72h之后 ,甘油开始反耗。     

鲁氏酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因（ZrGPD1）在粉状毕赤酵母中的表达

为探索在野生型粉状毕赤酵母（Pichia farinosa）中整合表达来源于耐高渗鲁氏酵母（Zygosacharomyces rouxii）的3-磷酸甘油脱氢酶基因（ZrGPD1）以提高产甘油能力的可行性,应用PCR方法从P. farinosa的染色体中扩增出乳清苷酸脱羧酶基因（URA3）片段,以此作为同源整合的靶序列,构建了整合型表达载体pUR-ZG。电击转化粉状毕赤酵母,以抗生素Zeocin为筛选标记,获得转化子pfa-gu,摇瓶发酵结果表明：以P. farinosa作为对照菌株,发酵72h后,转化子pfa-gu的生物量和甘油含量均高于对照菌株,其中甘油含量达到37g/L,比对照提高了30%。结论：在P. farinosa中异源表达ZrGPD1能够提高细胞的产甘油能力和对渗透压的调节能力。     

新一代高产甘油重组菌的构建及其初步发酵

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力,本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1,构建根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1后,电击转化根癌农杆菌LBA4404,通过根癌农杆菌介导法(ATMT)转化产甘油假丝酵母,构建了产甘油假丝酵母重组菌。并从中筛选出一株酶活力和产甘油性能较好的产甘油假丝酵母重组菌株C.g-G8。以葡萄糖为底物摇瓶发酵96h后,重组菌C.g-G8的甘油产量比野生型菌株Candida glycerinogene提高18.06%,平均耗糖速率提高12.97%,平均酶活力提高27.55%。本研究成功利用ATMT法转化产甘油假丝酵母构建新一代高产甘油菌株。     

玉米浆在产甘油假丝酵母甘油发酵中的作用机理

以复合培养基和合成培养基进行比较发酵,研究了玉米浆在产甘油假丝酵母甘油发酵过程中的作用机理。结果表明:玉米浆中的磷、氮和微量元素是影响产甘油假丝酵母甘油发酵的3个关键因素。当玉米浆磷浓度为121·75mg/L(玉米浆浓度为14g/L),最大甘油转化率达到53·44%。玉米浆磷可以调节EMP途径与HMP途径之间碳架代谢流的分布,随着玉米浆浓度进一步增加,过量磷能抑制HMP途径而激活EMP途径,因而复合培养基各项发酵参数的变化非常显著。玉米浆氮对磷的调节功能有协同作用,但并不是产甘油假丝酵母甘油发酵的理想氮源。玉米浆中的微量元素能够显著提高葡萄糖的消耗速率、促进菌体的生长和增加甘油的产量。     

固定化细胞技术发酵玉米醪生产酒精的研究

本文报导了固定化酵母(S.cerevisiae 9064)批次发酵玉米醪生产酒精的研究。采用自制“多层分隔式生物反应器”在最适发酵条件下,成熟醪的终酒精浓度达10％(V/V)左右,发酵时间可由传统发酵的72h缩短到22h左右,酒精生产力提高了3倍。在吨级反应器连续运转试验时,固定化增殖酵母细胞活性稳定性可持续半年以上,PVA—凝胶粒的机械强度和弹性等以及醪液中酒精含量基本保持不变。     

锁掷酵母预处理油脂原料膨化大豆

通过3株红酵母对膨化大豆进行固态发酵预处理,油脂和豆粕中类胡萝卜素的含量都显著增加,且油脂中脂肪酸组成没有显著变化.其中,锁掷酵母发酵膨化大豆所提取的油脂中类胡萝卜素含量最高,为15.010 μg/g,比未发酵样品提高了5.526倍.进一步对锁掷酵母固态发酵进行工艺优化,培养时间、培养基含水量、接种量和发酵温度均显著影...     

葡萄酒中酵母菌高产甘油的研究进展

甘油是酵母菌酒精发酵过程中的副产物,甘油作为非挥发性物质,对葡萄酒的香气没有贡献,但是其黏性和甜味,可使葡萄酒具有圆润、柔滑、甘甜、肥硕、更易入口的特性,也可用于平衡酒中的酸感,增加口感复杂性,是高品质果酒的重要成分。近年来,国内外对高产甘油酵母的研究日益增多,着重于提高葡萄酒中酵母发酵生产甘油的能力。     

甘油代谢中甘油激酶的研究进展

甘油作为重要的化工原料 ,其生产一直受到国内外的广泛关注。发酵法生产甘油是除皂化法和化学合成法外生产甘油的第三条途径。江南大学 (原无锡轻工大学 )在 90年代已成功地应用产甘油假丝酵母实现了工业化生产甘油 ,经江南大学研究人员多年不断努力 ,产甘油假丝酵母ＷＬ - 2 0 0 2 - 5发酵甘油可达 1 2 %以上 ,总糖转化率超过 5 1 % ,产率 3 0ｇ·Ｌ- 1ｄ- 1,发酵时间在 72～ 96ｈ。迄今为止 ,该菌株及专利技术已被多家企业运用于实际生产中[1,2 ] 。研究人员继续进行了多方面的研究 ,如运用穿梭载体建立产甘油假丝酵母质粒基因文库[3 ] 、…     

限磷对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

研究了磷酸盐限量对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明, 当酵母细胞从适磷或富磷培养基转接入低磷培养基时, 发酵过程中胞内积累的磷逐渐减少; 而当菌体从低磷培养基转接入适磷或富磷培养基时, 发酵过程中胞内聚磷酸盐的积累量迅速增加。当细胞在第14小时和第38小时从适磷培养基转接入低磷培养基时甘油得率分别高达60.9%和61.4%, 而甘油产率则分别为2.03 g/(L·h)和2.23 g/(L·h)。这些现象说明限制发酵培养基中的磷浓度是产甘油假丝酵母高产甘油的必要条件, 并为其反复分批发酵法生产甘油提供了重要依据。     

毕赤酵母发酵产S-腺苷蛋氨酸的甘油-甲醇混合流加策略

在毕赤酵母发酵生产S-腺苷蛋氨酸(SAM)的诱导阶段,以不同甘油-甲醇比例的甘油-甲醇混合培养基进行诱导培养,结果表明以10%(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合培养基进行诱导培养时最有利于SAM的表达,SAM产量达6.09 g/L,比0%甘油含量条件下的SAM产量提高了20.4%。对诱导方式进行优化,先以100%甲醇诱导24 h,然后再连续流加10%(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合培养基,SAM产量可达7.94 g/L,在此基础上,进一步改进诱导方式,SAM产量得到进一步的提高,达到9.80 g/L。     

CASA酵母固定化方法的研究

为了增加同定化酵母的使用时间,本文在交联海藻酸钙包埋法的基础上,引入柠檬酸强化剂,制成柠檬酸强化海藻酸钙固定化酵母。它的机械强度与海藻酸钙无差別。由于柠檬酸的络合作用,阻止了钙离子的溶出,因此,在磷酸缓冲液中稳定。载体内微环境的改变,提高了发酵活性,使发酵时间缩短为16小时。     

甘蔗糖蜜酒精废液混菌发酵菌体蛋白的研究

本文报导利用甘蔗糖蜜酒精废液混菌发酵高质量菌体蛋白的研究,通过热带假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ种合融合株Ｃｔ－３配伍其他菌株,混菌发酵时间缩短２￣４ｈ,生物量可达２０ｇ／Ｌ,粗蛋白质含量５０￣５３％,灰份≤１０％,水分为５￣８％,与Ｃｔ－３单菌发酵相比,蛋白质提高４￣６％。     

磁场对红酵母的生长及类胡萝卜素合成的影响

考察直流电磁场对类胡萝卜素产生前红酵母RG-98的生长及代谢的影响。结果表明,不同的磁场强度、处理时间及处理方式会产生不同的生物效应。将液体种子和发酵培养基一起置于0.10T电磁场处理2h,能使色素的发酵产量提高25％。比较经磁场处理与未经处理的发酵过程,发现磁场处理提高了红酵母对糖的代谢速率,并且在发酵后期促进生物量和色素含量持续地增加。     

热带假丝酵母高效利用甘油研究

目的:热带假丝酵母以油脂为底物发酵时会产生副产物甘油,研究对热带假丝酵母gk基因进行过表达,将副产物甘油转化为能量,提高油脂转化利用效率。方法:以热带假丝酵母Candida tropicalis 1798中的甘油激酶(gk)为研究对象,利用PCR技术获得同源臂基因gkpR,通过一步法无缝克隆将同源臂和G418抗性基因(kanr)连接至pPICzαA载体,同时将解脂假丝酵母Candida lipolytica 1457中的启动子基因pGAP无缝连接至载体中的gkpR,构成质粒pPICzαA-gkp,并电转化至C.tropicalis 1798感受态细胞中,通过一次同源单交换,将启动子pGK替换为pGAP。结果:经过G418抗性筛选和PCR鉴定,成功获得pGAP基因替换菌株C.tropicalis 1798-gkPr;发酵验证结果显示,启动子基因替换C.tropicalis 1798在以甘油为底物培养时重组菌OD600值比野生型菌株高46.4%,重组菌培养基中甘油剩余量比野生菌降低56.1%,表明启动子替换能促进C.tropicalis1798对甘油的吸收利用。此外,以油脂为底物进行发酵实验时还发现重组菌产长链二元酸的量比野生菌提高32.7%。结论:通过启动子替换手段构建的重组菌C.tropicalis 1798-gkPr,提高了热带假丝酵母对油脂组分中甘油成分的利用效率。     

产甘油假丝酵母甘油代谢关键酶的研究

本文对产甘油假丝酵母的甘油代谢关键酶进行了研究,发现产甘油假丝酵母同化甘油能力极弱,少量葡萄糖明显改善其同化甘油的能力;线粒体3磷酸甘油脱氢酶受3磷酸甘油的强烈诱导,受葡萄糖代谢的阻遏。在甘油发酵过程中,产甘油假丝酵母胞浆3磷酸甘油脱氢酶酶活处于较高水平并在36h和60h时出现两次酶活高峰,其中第一次酶活峰值水平决定产甘油假丝酵母的甘油合成和积累水平,成为甘油高速积累期(18～48h)甘油合成的关键性的限速酶。在甘油发酵18～48h内,3磷酸甘油酯酶的酶活处于高水平,并在36h时出现酶活峰值;处于缓慢甘油积累阶段的48～72h间,3磷酸甘油酯酶已处于低水平表达,此时,3磷酸甘油酯酶则成为甘油合成的限速酶。产甘油假丝酵母稳定并高表达其胞浆3磷酸甘油脱氢酶基因并且其所表达的3磷酸甘油酯酶酶活远高于胞浆3磷酸甘油脱氢酶这一特征是其高产甘油根本所在。     

不同渗透压调节剂对Candida krusei生理代谢的影响

比较了氯化钠、氯化钾、甘露醇存在的高渗环境下克鲁氏假丝酵母(Candida kru-sei)的生理代谢。3种渗透压调节剂对C.krusei生理代谢影响有显著差异。与甘露醇相比,氯化钠和氯化钾对细胞生长的影响更为显著,而氯化钾对细胞的毒性则又小于氯化钠。细胞对糖的消耗速率依次为甘露醇>氯化钾>氯化钠。甘油和海藻糖是C.krusei在高渗环境下的主要相容性溶质。氯化钠和氯化钾对甘油合成的促进作用明显高于甘露醇。在0.6mol/L氯化钠、氯化钾、甘露醇存在时,细胞甘油浓度较对照提高了74%、63%、57%;胞内甘油最大含量也分别达到对照的3.1,2.4和1.8倍。高渗环境下胞内海藻糖含量在发酵前期均有所降低,但发酵后期在0.6mol/L氯化钾和甘露醇存在时海藻糖迅速积累,其含量分别达对照的1.6和1.4倍。     

酿酒酵母和异常毕赤酵母混菌发酵对白酒液态发酵效率和风味物质的影响

[目的]通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和异常毕赤酵母(Pichia anomala)在麸皮汁培养基中的混菌发酵,以增加发酵液的风味酯含量并保证发酵效率.[方法]采用两种酵母混合接种、顺序接种混菌发酵方式,以酵母单独接种发酵作对照,测定酵母的发酵性能和发酵液中乙酸乙酯含量,并对发酵结束时风味物质进行半定量;利用无细胞系统,分析两种酵母之间的相互作用.[结果]采用顺序接种混菌发酵方式,避免S.cerevisiae 对P.anomala的生长竞争性抑制,使两种酵母均能获得较高的生物量;发酵结束时,乙醇浓度为20.17 g/L,比酿酒酵母单菌种发酵时降低了9.14％;但乙酸乙酯含量达到0.74 g/L,比异常毕赤酵母单菌种发酵时提高了80％;发酵液风味物质的测定结果表明,酿酒酵母与异常毕赤酵母的混合发酵能够形成更多的酯类物质,总酸和高级醇含量却相对较低,有效改善了发酵液的风味特性;在混菌发酵时,碳源是影响酿酒酵母繁殖的重要因素,但酵母的代谢物对异常毕赤酵母产生明显的抑制作用.[结论]混菌发酵,为丰富发酵产物的风味复杂性和增强风格的独特性提供了一条有效的途径.     

毕赤酵母高密度发酵产Ⅲ型类人胶原蛋白及其胃粘膜修复功能

为提高重组毕赤酵母Pichia pastoris发酵重组人Ⅲ型胶原蛋白产量,采用响应面对其生长阶段的BMGY培养基(Buffered minimal glycerol-complex medium)组成进行优化。通过Placket-Burman试验,得出酵母提取物、蛋白胨、甘油对胶原蛋白产量有显著影响,通过Box-Behnken中心组合实验以及Design-Expert分析软件建立了以胶原蛋白产量为响应值的响应方程,得到最适浓度分别为酵母提取物1.13%,蛋白胨1.61%,甘油0.86%。经实验验证,在最优BMGY培养基条件下培养12 h后,所得到毕赤酵母干重为4.41 g/L,生长阶段的菌重量增加了26%。在22 L发酵罐中通过高密度发酵,产量达到4.71 g/L。该重组胶原蛋白对大鼠乙酸灼伤胃粘膜有明显修复作用,为生物医用材料的应用制备奠定了基础。     

啤酒生产中双乙酰形成的分子遗传学及其控制

双乙酰是啤酒中的重要风味物质,也是影响啤酒成熟和质量的关键因素之一。双乙酰是由酵母缬氨酸生物合成的中间产物α－乙酰乳酸经氧化脱羧产生的。目前,可以通过改良传统发酵工艺,添加酶制剂以及利用基因工程手段选育酵母工程菌等方法降低双乙酰在啤酒中的含量,缩短啤酒后酵期,以加速啤酒成熟。