肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础.采用PCR扩增方法获取P1结构基因.扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化,回收1kb大小的DNA片段并与pUC19DNA连接,转入大肠杆菌JM109菌株.用X-gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定.经PCR扩增MPDNA获得1条5.0kbDNA片段.重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出2条带,1条为pUC19载体DNA带,另1条是1kb的插入片段.实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株.     

放线菌的单酶切AFLP基因分型研究

使用MseI限制性内切酶对放线菌链霉菌属中的12株菌基因组DNA进行酶切,与接头连接后,引物使用一个选择性碱基对模板进行PCR扩增,PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。结果表明,对于MseI内切酶产生的模板,选择性碱基采用A、T、C和G都能够获得清晰丰富的条带。MseI内切酶产生的图谱上有72个位点,多态性位点71个,达98．6％。因此,使用MseI内切酶适合构建放线菌的单酶切AFLP指纹图谱。     

一种改良的启动子序列克隆的染色体步查法

利用染色体步行法,从已知DNA序列克隆侧翼未知序列是非常有效的方法之一,但由于所选用的特定限制性内切酶对目标基因组不能酶解成合适大小的片段,因而受PCR扩增能力的局限,往往扩增不出有效产物. 针对这一点,这里我们介绍一种简单有效的改良方法,它包括以下步骤：首先用不同的限制性内切酶(包括平末端和粘性末端) 酶解目标基因组DNA,接着,选择能将基因组酶切成弥散、分布均匀的限制性内切酶,如DraⅠ和HindⅢ,合成相对应的接头;然后,选择弥散的、分布均匀的限制性内切酶的酶解产物,构建成含相应接头的基因组DNA文库,用作PCR的模板;最后,用接头引物和特异引物,通过巢式PCR扩增目的片段,获得了理想的扩增效果.采用改进后的染色体步查法,有效地从较复杂的棉花核DNA中克隆出6个棉花启动子序列.     

一种乌鳢与斑鳢线粒体PCR-RFLP鉴定方法

为了高效的鉴别乌鳢与斑鳢,采用PCR-RFLP技术,对乌鳢与斑鳢开展分子生物学鉴定方法研究。通过比对乌鳢和斑鳢线粒体全序列,发现1处单核苷酸多态性位点,可以明确区分两个物种。利用1对引物对乌鳢与斑鳢线粒体基因组该区域进行PCR扩增,用限制性内切酶EcoR I分别对扩增产物进行酶切,并用1.5%的琼脂糖凝胶检测酶切结果。PCR-RFLP检测结果显示,斑鳢的PCR扩增产物被EcoR I酶切后生成两个不同大小的片段,分别为315 bp和875 bp,乌鳢则保持不变。由此可将乌鳢与斑鳢在酶切图谱上鉴别出来。     

水稻二化螟和三化螟基因组ddRADseq文库的构建

本文介绍了构建水稻二化螟和三化螟"双酶切限制性酶切位点关联DNA测序"(Double digest restrictionsite associated DNA sequencing,ddRADseq)文库的方法。利用安捷伦2100生物分析仪对4种单酶切及2种双酶切的酶切产物片段大小及分布范围进行分析,筛选出Mlu C I和Nla III两种限制性内切酶组合对螟虫基因组DNA进行酶切。酶切后的DNA片段两端连接上特定的P1、P2接头后,用Pippin Prep回收大小为285-435 bp的DNA片段。通过PCR扩增进行文库的富集并引入index序列。构建好的ddRADseq文库用琼脂糖凝胶电泳和生物分析仪进行质量检测。本方法所构建的文库DNA片段长度、分布和摩尔浓度能够达到Illumina平台测序的技术要求。本研究证实了利用Mlu C I和Nla III组合酶切构建水稻螟虫基因组ddRADseq文库的可行性,为在水稻螟虫中利用ddRADseq技术开展生物地理学、种群遗传学和系统发育重建等方面的研究奠定基础。     

乳酸乳球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

用酚抽提的方法提取乳酸乳球菌的基因组DNA,利用PCR方法从乳酸菌的基因组DNA中扩增出含有苹果酸-乳酸酶基因(malolactic enzyme gene,mle)的约1.6kb的DNA片断,用1%的琼脂糖凝胶分离扩增的片断,用试剂盒回收目的基因。将回收的目的基因与pGEM-T载体连接构建mle-T载体并转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性克隆(白色菌落),酶切鉴定并测序。SalI酶切mle-T,回收mle DNA片断,与表达载体pET-28a载体连接,构建细菌Escherichia coli表达载体。     

实验2 回收DNA限制性酶切片段

一、琼脂糖凝胶电泳洗脱回收 1.DNA经限制性内切酶消化后,琼脂糖凝胶电泳。在紫外灯下检测确定需要回收的DNA条带,用刀片将含此条带的凝胶切下。 2.透析袋里装满电泳缓冲液,将切下的凝胶条块装入透析袋,挤出多余的缓冲液,袋里只留下少量缓冲液且无气泡。 3.让透析袋里的凝胶切断面同电流方向垂直。透     

放线菌的单酶切AFLP基因分子型研究

使用MseI限制性内切酶对放线菌链霉菌属中的12株菌基因组DNA进行酶切,与接头连接后,引物使用一个选择性碱基对模板进行PCR扩增,PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测.结果表明,对于MseI内切酶产生的模板,选择性碱基采用A、T、C和G都能够获得清晰丰富的条带.MseI内切酶产生的图谱上有72个位点,多态性位点71个,达98.6%.因此,使用MseI内切酶适合构建放线菌的单酶切AFLP指纹图谱.     

光敏生物素标记法制备HPV DNA探针

本文将PBR322与HPV重组质粒DNA转化大肠杆菌HB101株,经氨苄青霉素—四环素平板筛选转化成功的菌落,将其扩增、提取质粒DNA,纯化后用限制性内切酶酶切,琼脂糖凝胶电泳区分不同大小的限制性内切片段,并用电洗脱法回收7.9Kb的HPV DNA片段。在高能卤素灯光照下标记光敏生物素制备HPV DNA探针,并检测其特异性和敏感性。结果表明:此探针具有较高敏感性,可达2.5pg;并且具有较强的特异性。     

限制性内切酶介导的重叠延伸在人环氧合酶-1(COX-1)基因克隆中的应用

建立一种用于克隆全长基因的、限制性内切酶介导的重叠延伸法 .对全长基因进行分段扩增 ,并利用适当的限制性内切酶对基因序列内相应的限制性位点进行酶切 ,从而使分段扩增片段得以重叠并互为模板 ,在DNA聚合酶的作用下延伸获得全长基因 .将环氧合酶 1 (COX 1 )基因的外显子 9巧妙地拼接到了缺失外显子 9的COX 1cDNA片段中 ,获得了COX 1基因的全长cDNA .该方法分 3步进行 .首先 ,通过RT PCR分别扩增跨外显子 9的cDNA片段和缺失外显子 9的cDNA片段 ,并克隆到pMD1 8 T载体上 ;其次 ,PCR扩增外显子 9片段 ,限制性内切酶StuI酶切缺失外显子9cDNA片段的重组质粒 ,二者以一定的比例混合 ,互为模板 ,在pfuDNA聚合酶的作用下进行延伸 ,从而产生一个双链的DNA分子 .最后 ,以延伸产物为模板 ,用COX 1cDNA两端的引物进行PCR扩增 ,产生包含外显子 9的COX 1基因的全长cDNA .这种限制性内切酶介导的重叠延伸方法 ,对于克隆mRNA剪接水平上受调控的基因尤为有用 ,同时也为基因的重组和修饰提供一个新的思路