黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究 Ⅰ.高产及低产菌株糖化酶表达的总体分析和比较

对黑曲霉(Aspergillus niger)高产菌株T21和原始菌株3.795糖化酶的基因表达从菌体生长、酶形成动力学、glaA基因拷贝数、糖化酶mRNA含量及其稳定性等多个方面进行了分析和比较。T21和3.795糖化酶的大量产生均自菌体生长的静止期开始。培养72h后,两者的菌体浓度相同,但T2l产生的糖化酶量为3.795的10～17倍,说明糖化酶产量的差异不是因生物量或酶起始合成期不同引起的,而是由于细胞内酶表达量不同引起的。Northern杂交显示T21总RNA中糖化酶mRNA含量为3.795的4.3～4.4倍.两菌株glaA基因拷贝数及糖化酶mRNA的稳定性分析结果排除了这两个因素的影响,因此T21糖化酶mRNA含量的增加主要是glaA基因转录水平提高的结果。T21与3.795之间糖化酶水平差异(10～17倍)与糖化酶mRNA水平差异(4.3～4.4倍)的不一致性,提示T21和3.795之间除转录水平外可能还存在着翻译水平上的差异(2～4倍)。此外,T21和3.795均存在着对糖化酶基因表达的碳源调控机制,根据两者在淀粉、麦芽糖和葡萄糖培养条件下所产生的mRNA比均为4:3:2,可以认为,这种调控作用…     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究──Ⅱ.A.niger T21和3.795glaA基因5''调控区功能的体内分析

对糖化酶高产菌株A.nigerT21和原始菌株Aniger3．795的glaA5＇上游区的序列分析证明,两者在1．5kb的区域内有9个部位的碱基不同。为考察这些碱基差异是否是引起T21glaA基因转录水平提高的原因,构建了以T21和3．795glaA基因转录调控区及A．Nidulans　trpC基因终止子为表达元件的E．Colihph基因表达载体（pXH2和pGH1）,用pXH2和pGH1分别转化A.nigerT21,对两种转化子的HmB抗性水平测定和Southern杂交分析显示,在转化子XH2C和GH1C中,pXH2和pGH1以相同拷贝数（2拷贝串联）整合到染色体DNA的相同位置上,XH2C的HmB抗性水平（3000μg／ml）为GH1C（1500μg／ml）的2倍。这一结果表明,诱变引起的调控区序列改变使T21glaA基因转录调控区的功能水平比3．795提高1倍。     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究──Ⅱ.A.niger T21和3.795glaA基因5''调控区功能的体内分析

对糖化酶高产菌株A.nigerT21和原始菌株Aniger3．795的glaA5＇上游区的序列分析证明,两者在1．5kb的区域内有9个部位的碱基不同。为考察这些碱基差异是否是引起T21glaA基因转录水平提高的原因,构建了以T21和3．795glaA基因转录调控区及A．nidulans　trpC基因终止子为表达元件的E．colihph基因表达载体（pXH2和pGH1）,用pXH2和pGH1分别转化A.nigerT21,对两种转化子的HmB抗性水平测定和Southern杂交分析显示,在转化子XH2C和GH1C中,pXH2和pGH1以相同拷贝数（2拷贝串联）整合到染色体DNA的相同位置上,XH2C的HmB抗性水平（3000μg／ml）为GH1C（1500μg／ml）的2倍。这一结果表明,诱变引起的调控区序列改变使T21glaA基因转录调控区的功能水平比3．795提高1倍。     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究：I.高产及低产菌株糖化酶表达…

对黑曲霉高产菌株Ｔ２１和原始菌株３．７９５糖化酶的基因表达从菌体生长、酶形成动力学、ｇｌａＡ基因拷贝数、糖化酶ｍＲＮＡ含量及其稳定性等多个方面进行了分析和比较。Ｔ２１和３．７９５糖化酶的大量产生均自菌体生长的静止期开始。培养７２ｈ捂得的菌体浓度相同,但Ｔ２１产生的糖化酶量为３．７９５的１０￣１７倍,说明糖化酶产量的差异不是因生物量或酶起始合成期不同引起的,而是由于细胞内酶表达量不同引起的。Ｎｏｒｔ     

黑曲霉诱变株Aspergillus niger T21糖化酶产量提高的分子基础

黑曲霉Aspergillus niger T21是以A.niger AS3.795为出发株经诱变获得的糖化酶高产菌株,产量比原株提高10~17倍.Northern分析知T21的糖化酶mRNA含量约为AS3. 795的20倍,表明糖化酶基因(glaA)转录水平的提高是糖化酶产量提高的主要原因.以编码葡糖苷酸酶(GUS)的E.coli uidA为报告基因,分别与T21和AS3.795的glaA 5′调控区融合后,引入A.niger,根据转化子GUS酶活性测定结果,T21glaA 5′调控区的启动子活性是AS3.795相应启动子活性的3倍多,提示cis调控的改变是T21glaA转录水平提高的重要原因之一,但trans调控的改变是T21glaA转录水平提高的更重要的原因. 作为trans调控研究的第1步,进行了T21glaA 5′调控区的功能分析,结果表明,ATG上游-408 ~-513间的约100 bp区域与 glaA基因高水平表达相关.     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

黑曲霉糖化酶高产株糖化酶cDNA的合成、克隆和序列分析

从黑曲霉糖化酶高产株T21分离总Poly(A)⁺RNA,经反转录合成cDNA,建立cDNA库。以糖化酶基因片段为探针从cDNA库进行筛选,阳性率达1．6％。由限制酶酶切图谱确定30％的阳性克隆携带全长的糖化酶cDNA。序列分析结果表明,菌株T21虽经多次诱变获得,但糖化酶基因编码区序列与文献报道的黑曲霉糖化酶基因编码区序列一致。从菌株T2l构建的cDNA库中含糖化酶cDNA插入片段的克隆的高比率充分证明,菌株T21中稳态糖化酶mRNA含量很高,显然这是突变株T21糖化酶高产的重要原因之一。     

携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究

以工业生产菌株黑曲霉CICIMF0410基因组DNA为模板,扩增出糖化酶glaA基因,测序并进行表达研究。GlaA基因的核苷酸序列长为2167bp,包含4个内含子。氨基酸序列比对表明此黑曲霉糖化酶与其他曲霉属来源的糖化酶有很高的同源性。将glaA基因克隆到pBC-Hygro载体中,构建重组质粒pBC-Hygro-glaA并转化A.nigerF0410。携多拷贝glaA的转化子用150μg/mL潮霉素抗性筛选并通过荧光实时定量PCR鉴定。结果表明,在染色体整合2~3倍糖化酶基因对糖化酶的过量合成是适宜的,有助于提高糖化酶活力。对转化子进行摇瓶发酵研究,发酵终止时转化子GB0506的糖化酶活力比出发菌株F0410提高了17.5%。因此,增加黑曲霉染色体糖化酶基因的拷贝数可以显著提高糖化酶活力。     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究：Ⅱ.A.niger T21和3.795glaA基因 …

对糖化酶高产菌株Ａ．ｎｉｇｅｒＴ２１和原始菌株Ａ．ｎｉｇｅｒ３．７９５和ｇｌａＡ５′上游区的序列分析证明,两者在１．５ｋｂ的区域内有９个部位的碱基不同。为考察这些碱基差异是否是引起Ｔ２１ｇｌａＡ基因转录水平提高的原因,构建了以Ｔ２１和３．７９５ａｌａＡ基因转录调控区及Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ基因终止子为表达元件的Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｐｈ基因表达载体（ｐＸＨ１２和ｐＧＨ１）,用ｐＸＨ２和ｐＧＨ１分     

黑曲霉糖化酶高产菌株的糖化酶结构基因的分离及其序列分析

从糖化酶高产菌株(Aspergills niger)T21中分离出染色体DNA.Southern印跡分析表明糖化酶结构基因位于约2.5kb的EcoRⅠ-EcoRV片段中.该染色体DNA经EcorⅠ、EcoRⅤ完全酶切后,用琼脂糖凝胶电泳分离,回收2.0—3.0kb的片段,与载体pBR322连接后转化宿主菌大肠杆菌DH5,获得转化子.通过原位杂交,从转化子中筛选出4个阳性克隆.阳性克隆的进一步酶切鉴定及序列分析表明,黑曲霉T21糖化酶结构基因大小为2.3kb,含有4个内含子.     

黑曲霉3.795glaA基因及其5'调控区的克隆和序列分析

黑曲霉Ｔ２１是由黑曲霉３．７９５经诱变育种获得的糖化酶高产菌株,为阐明其高产的分子机制,由黑曲霉３．７９５克隆了糖化酶结构基因及其５′旁侧序列,并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较．由黑曲霉３．７９５菌丝体分离染色体ＤＮＡ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,糖化酶结构基因位于～２．５ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＥｃｏＲⅤ染色体ＤＮＡ片段上,在此ＥｃｏＲⅠ位点上游约１．０ｋｂ处有一ＳａｌⅠ位点．为构建糖化酶结构基因及其５′旁侧序列的基因组文库,该染色体ＤＮＡ分别用ＥｃｏＲⅠ＋ＥｃｏＲⅤ和ＥｃｏＲ＋ＳａｌⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分离并回收长度在１．０ｋｂ左右和２．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段,分别与ｐＵＣ１９载体连接后转化入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５．用原位杂交方法筛选到了携带糖化酶基因编码区及其１５０５ｂｐ５′旁侧序列的阳性克隆．对克隆片段的ＤＮＡ序列进行了测定并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较,结果表明,在糖化酶基因编码区及其１５０ｂｐ３′非编码区内,未发现碱基差异,但在－３４０～－１５０５的５′上游区内发生了９个位置的碱基变化,包括缺失、插入和替换．这些结果表明,黑曲霉Ｔ２１与３．７９５的糖化酶产量的差异与其结构基因无关,但可能与其     

黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因在工业用酿酒酵母中的共表达

构建了黑曲霉糖化酶、木聚糖酶基因双表达的酵母YIp型载体pNEW4,通过与G418抗性质粒共转化,将糖化酶和木聚糖酶基因表达元件整合到多倍体酒精生产用酵母S. cerevisiae2.346染色体上,获得了整合型分泌表达这两种酶的工业酿酒酵母工程菌株GX11,研究了重组糖化酶和木聚糖酶在酵母工程菌中的表达及性质。