棉蚜细胞色素P450 CYP6J1的克隆与表达

为了深入了解细胞色素P450 CYP6J1蛋白的结构和功能,本实验克隆获得了棉蚜Aphis gossypii P450CYP6J1基因,对该基因进行信息学及原核表达分析,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达结果,并用Western-blot进行验证。结果表明,P450 CYP6J1序列长1 398 bp,编码氨基酸数为465,理论分子量为53.67 k D,理论等电点为8.80。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。同源性分析表明,棉蚜c DNA序列推导的氨基酸与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的保守性最为接近,一致性可达92%。在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达获得的His-CYP6J1蛋白,并用Western-blot检测目的蛋白大小正确。这些研究结果为棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗体制备提供了基础。     

青海湖裸鲤CYP17a2基因的克隆及表达分析

CYP17a2基因是细胞色素CYP17(cytochrome P450,CYP)超家族成员之一,在卵巢发育过程中,可以与CYP17a1共同作用控制卵子的发育和成熟。研究和掌握青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)卵巢发育的基本规律,可为该鱼种的人工增殖放流及其资源保护和恢复提供技术支撑。本研究采用普通PCR和RACE方法克隆得到了青海湖裸鲤CYP17a2基因全长c DNA序列,并分析了其生物信息学意义,通过实时荧光定量PCR确定了CYP17a2基因在青海湖雌性裸鲤各组织中的表达分布特征。该基因的c DNA序列全长为1 871 bp,共编码390个氨基酸,所编码的氨基酸序列与斑马鱼和鲤鱼的同源性最高,分别为69%和64%。该基因在卵巢、卵巢膜、脑、肌肉、肝胰脏中均有表达,以在卵巢中表达量最高(p0.01)。本研究结果将为进一步开展CYP17a2基因在青海湖裸鲤卵巢发育的分子调节机理的研究中提供基础数据。     

孟氏隐唇瓢虫气味结合蛋白ComOBP1基因的克隆和时空表达

采用RT-PCR和RACE技术,从孟氏隐唇瓢虫Cryptolaemus montrouzieri Mulsant中成功克隆出气味结合蛋白(Com OBP1)基因的全序列(Genbank登陆号:KU170686)。Com OBP1基因全长922 bp,包括5'端长为40 bp的非编码区域(UTR),及3'端长为462 bp的UTR,开放阅读框ORF长为420 bp,编码139个氨基酸,预测的分子量为15.516 k Da,等电点p I为6.57,存在AATAAA加尾信号。N-末端疏水区包含由20个氨基酸构成的信号肽,无跨膜结构,有4个保守的半胱氨酸,属于Minus-C OBP,也是在孟氏隐唇瓢虫中发现的第一个Minus-C OBP。氨基酸序列中有且仅有一个N-糖基化位点为62 NLSA,并存在2个潜在的磷酸化位点。与其它昆虫的Minus-C OBPs进行同源性比较并构建系统发育树,发现与同为鞘翅目Coleoptera昆虫的同源性较高。利用Real-time PCR、RT-PCR技术对Cmon OBP1基因在孟氏隐唇瓢虫不同发育阶段,不同组织,不同营养条件及不同食性下的表达水平进行了测定,结果显示,Cmon OBP1基因在整个发育阶段均有表达,雄性成虫期具有最高表达量,且多在成虫的头部及翅部表达。当营养条件发生变化时,表达丰度不会发生变化,当猎物由天然猎物柑橘粉蚧Planococcus citri Risso变成碗豆修尾蚜Megoura japonica Matsumura时,表达量会明显下降。该结果表明,孟氏隐唇瓢虫的不同发育阶段、不同组织及猎物种类会影响Cmon OBP1基因的表达,从而进一步影响其嗅觉行为。同时,Cmon OBP1基因可能在雄虫相关的信息素感受过程中发挥着重要作用。     

丹参香豆酸-3-羟化酶基因(SmC3H)的生物信息学及其组织表达模式分析

通过分析丹参转录组数据库(SRX021907)得到一条香豆酸-3-羟化酶(C3H)基因,blast比对发现该基因为丹参C3H(EU358957.1),该基因c DNA全长1 704 bp,包括1个1 503 bp的开放阅读框,编码508个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码蛋白的分子量为57.21 k D,等电点为8.53,含琢-螺旋,延伸链和无规则卷曲,具有1个细胞色素P450蛋白(CYP450)特异的保守结构域。聚类分析表明其与芝麻的亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,该基因在茎中的表达量最丰富,其次是叶和花,根中最低。     

桔小实蝇CYP4D46的克隆及其组织特异性表达研究

从桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)成虫体内提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术获得了一个新的细胞色素P450基因cDNA序列全长.该基因经细胞色素P450基因命名委员会命名为CYP4D46(Gen-Bank登录号:GU292422),其cDNA全长为1717 bp,包含1530 bp的完整开放阅读框(ORF),编码510个氨基酸,理论分子量约为58.40 kD,等电点为8.82.系统发育分析表明该基因与昆虫第4家族P450基因具有较高的同源性.实时定量PCR分析发现,CYP4D46基因在脂肪体中的相对表达量较高,分别是马氏管和中肠内的756倍和60倍,说明CYP4D46可能与脂肪体的重要生理功能相关.     

西花蓟马细胞色素P450基因cDNA片段克隆与mRNA表达分析

细胞色素P450介导的解毒作用增强是昆虫对杀虫剂产生抗性的重要机制。本文通过RT-PCR克隆了西花蓟马CYP4家族5个细胞色素P450基因c DNA片段。多重序列比对发现,这5个基因在氨基酸水平的一致性在40%-76%之间。采用实时荧光定量PCR对5个CYP4基因的mRNA表达水平的分析发现,阿维菌素抗性品系CYP4-1、CYP4-2和CYP4-5的表达水平分别是敏感品系的3.50、4.00和2.48倍,表明西花蓟马对阿维菌素的抗性可能与这3个CYP4基因的过量表达相关。     

小菜蛾CYP6基因序列分析及其进化地位探讨

利用简并引物和特异性引物,通过RT-PCR和RACE技术,克隆出了一个小菜蛾细胞色素P450CYP6基因。该基因全长1661bp,编码区在26~1570位,翻译514个氨基酸,GenBank登录号为AY971374。分析该基因在昆虫CYP6基因家族系谱树中的位置和5′-UTR的序列,可以认为,小菜蛾CYP6基因与同为鳞翅目的其他昆虫进化地位相当,而明显与相对低等的蜚蠊目昆虫的同家族基因亲缘关系远。     

黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因cDNA的克隆和表达分析

11β-羟化酶(11β-hydroxylase)由P450(11β)(Cytochrome P450 11β-hydroxylase)基因编码,是一种重要的线粒体酶,指导合成11-羟睾酮,11-羟睾酮是合成硬骨鱼中最重要的雄性激素11-KT的前体物质,参与精子发生过程。本研究首先利用RT-PCR和RACE技术克隆了黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因c DNA全长序列,然后利用生物信息学进行了分析,最后利用RT-PCR和荧光定量PCR方法对不同组织的表达情况进行了研究。结果显示:黄鳝P450(11β)基因c DNA全长为1 812 bp,开放阅读框1 632 bp共编码544个氨基酸氨基酸,5'非编码区(5'UTR)9个碱基,3'非编码区(3'UTR)168个碱基。黄鳝P450(11β)基因结构的保守性较高,具有细胞色素P450超家族基因的5个特征区域。氨基酸序列同源性分析表明黄鳝与其他鱼类的同源性在64%~76%之间,与舌齿鲈同源性最高为77%,但与人和老鼠的相似度仅为41.9%和37.7%。系统进化树分析以哺乳类为外群,黄鳝与点带石斑鱼、罗非鱼、舌齿鲈等聚为一大支。基因表达显示黄鳝P450(11β)基因在性腺和脑组织中表达,尤其在精巢中高表达,在卵巢中几乎检测不到。表明该基因对精子发生和精巢发育过程起着一定的作用。     

翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的克隆及表达研究

采用同源克隆与SMART RACE技术首次分离和克隆了翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的c DNA全长,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术分析了其在翘嘴鳜成体不同组织及性腺不同发育时期的表达特点。序列分析结果显示,CYP19a基因全长1 873 bp(Gen Bank登录号为KX911988),其中开放阅读框长1 581 bp,编码526个氨基酸。通过多序列比对,发现该基因编码的蛋白质具有P450arom A特定的功能保守序列,包括I-螺旋区、Ozol肽区、亚铁血红素结合区域以及芳香化酶特异性结合区域;同时,CYP19a基因序列的同源性分析结果显示,其在脊椎动物中较为保守。此外,q PCR检测结果显示,CYP19a基因在翘嘴鳜成体组织中的表达存在显著差异(P0.05),主要在性腺中表达,其次在脑和肝脏有少量表达;而且CYP19a基因在繁殖期性腺中的表达量显著低于非繁殖期性腺中的表达量(P0.05)。以上研究表明,CYP19a基因在鱼类性腺形成及发育过程中具有重要作用。     

三疣梭子蟹Spook基因克隆及其表达分析

甲壳动物蜕皮激素(Ecdysteroids)主要在Y器官(YO)中合成与分泌,参与调控蜕皮、繁殖等多项生理活动。Spook基因编码的细胞色素P450(CYP)307a1是蜕皮激素合成通路早期的关键酶。为了研究其在三疣梭子蟹蜕皮过程中的调控作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆得到了三疣梭子蟹Spook基因的全长c DNA序列(GenBank登录号:KM030021)。该序列全长为2 200 bp,包含一个长度为1 563 bp的开放阅读框,编码520个氨基酸;比对分析显示该氨基酸序列含helix-C、helix-K、helix-I、PERF、heme-binding 5个P450特征保守区域;系统进化树分析发现推导的三疣梭子蟹Spook蛋白与其他物种Spook聚为一支,而其他Halloween基因则分别聚为一支,表明推导的氨基酸确实是三疣梭子蟹Spook的蛋白序列。采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了其在不同组织中的表达情况,结果显示Spook基因主要在三疣梭子蟹的YO中表达。在三疣梭子蟹的蜕皮周期中,Spook基因的表达水平自蜕皮后期(A、B期)逐渐上升,并在蜕皮间期(C期)上升至最大,随后在蜕皮前期逐渐下降至D_3、D_4亚期最低。研究结果表明Spook基因可能参与调控三疣梭子蟹的蜕皮过程。