体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的:研究体外大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs)。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V/PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中蛋白的变化。结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组(无缺血缺氧)与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K(Phosphoinosi-tide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活(P<0.05);同时缺血缺氧组与缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组比较,缺血缺氧+PI3K/Akt抑制剂(LY294002)组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制(P<0.05)。结论:PI3K/Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。     

体外缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡发生的机制研究

目的：研究体外大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）在缺血缺氧条件下发生凋亡的作用机制。方法：采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞（MNCs）,于体外培养并由牛垂体提取物（PEX）诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞（MSCs）。经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,骨髓间充质干细胞（BMSCs）在缺血缺氧条件下培养,通过Annexin V／PI双染细胞凋亡检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法（western blot）来观察细胞中蛋白的变化。结果：①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功。②对照组（无缺血缺氧）与缺血缺氧组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,而通过磷酸化Akt的表达量显著性增加提示PI3K（Phosphoinositide-3kinase）／Akt（ProteinkinaseB,PKB）信号通路被激活（P〈0．05）;同时缺血缺氧组与缺血缺氧＋PI3K／Akt抑制剂（LY294002）组比较,缺血缺氧＋PI3K／Akt抑制剂（LY294002）组的凋亡率显著降低,而通过磷酸化Akt的表达量显著减少提示PI3K/Akt信号通路被抑制（P〈0．05）。结论：PI3K／Akt信号通路对体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞凋亡发生有关键性作用。     

恒磁场抑制缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡

目的:研究恒磁场对体外缺血缺氧培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs) 凋亡的影响并探讨其作用机制.方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs).经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,将骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过TUNEL检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中特定蛋白质的变化.结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功.②缺血/缺氧组与缺血/缺氧+磁场组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,Akt磷酸化水平显著上升(P＜0.05).提示恒磁场可以使PI3K(Phosphoinositide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活而抑制凋亡的发生.结论:恒磁场通过激活PI3K/Akt信号通路抑制体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞的凋亡.     

缺氧环境下大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡及Fas、Fas-L的表达

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在缺氧环境下是否存在凋亡及Fas和Fas-L蛋白在MSCs凋亡时是否表达及与细胞凋亡的相关性。方法将接种的P3细胞置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱中37℃孵育,分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和12h取出进行缺口末端标记(TUNEL)计算细胞凋亡指数(ApoptoticIndex,AI)和透射电镜观察细胞超微结构的改变,用Fas和Fas-L免疫组化试剂盒检测Fas-L和Fas蛋白的表达。结果1.培养的骨髓单个核细胞CD29、CD71、CD44免疫细胞化学染色均阳性,CD34染色阴性,5-氮胞苷诱导后表达TnT,提示其为MSCs。2.MSCs在缺氧前、缺氧0.5、1、2、4、6、8和12h时AI分别为0.11±2.03%、15.4±3.19%、16.7±2.51%、16.9±0.25%、17.7±2.50%、18.3±3.15%、18.4±4.22%、19.7±4.58%,缺氧不同时间点AI较缺氧前均显著性增高(P<0.01),并随着缺氧时间延伸,AI显著增加(P<0.05),不过,缺氧6h、8h和12h时AI没有统计学意义(P>0.05)。3.MSCs在不同缺氧时间点Fas、Fas-L蛋白表达较缺氧前均显著性增高(P<0.05),且随着缺氧时间延伸,表达显著增加,而在缺氧6h-12h时间点表达没有统计学意义(P>0.05)。3.缺氧0.5、1、2、4、6、8和12h,AI与Fas和Fas-L均显著正相关。结论缺氧是促进MSCs凋亡的重要因素,Fas和Fas-L蛋白可能在MSCs缺氧凋亡的调控中起着重要作用。     

Akt基因转染对骨髓间充质干细胞缺氧时凋亡和增殖的影响

目的采用Akt基因转染鼠骨髓MSCs探讨Akt基因是否减轻MSCs缺氧时的凋亡和提高缺氧时的增殖能力,即耐缺氧能力。方法将转染和未转染Akt基因的MSCs置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱中37℃孵育不同时间（常氧、缺氧0.5h、1h、2h、4h和8h）后,Annexin V/PI双染法行流式细胞仪分析凋亡率（apoptoticrate,AR）和死亡率（deadrate,DR）、MTT法分析细胞增殖状态、Rt-PCR和Western blot等检测Akt和p-Akt表达以及放射同位素法检测MSCs对氚标-葡萄糖（^3H-G）的摄取等。结果1.Akt基因显著降低MSCs缺氧时AR和DR（P〈0.01）,而各缺氧时间点没有统计学意义（P〉0.05）;2.Akt基因显著增高MSCs常氧和缺氧（与未转染Akt基因MSCs同等条件下比较）时增殖能力（P〈0.01）,缺氧时增殖能力显著低于常氧时（P〈0.01）;3.Akt基因显著增高常氧时MSCsAkt mRNA（P〈0.01）和蛋白（P〈0.01）表达,而不增高p-Akt蛋白（P〉0.05）表达;Akt基因显著提高缺氧时p-Akt蛋白（P〈0.01）表达,而不提高常氧时p-Akt蛋白（P〉0.05）表达;4.Akt基因显著增高MSCs常氧和缺氧（与未转染Akt基因MSCs同等条件下比较）时^3H-G的摄取（P〈0.01）,缺氧时^3H-G的摄取显著性低于常氧培养时（P〈0.01）;^3H-G的摄取与细胞增殖显著正相关（r=0.79,P=0.015）而与细胞凋亡显著负相关（r=-1.47,P=0.023）。结论Akt基因转染可显著提高MSCs耐缺氧能力,此可能与缺氧时改善MSCs葡萄糖摄取等有关。     

溶血磷脂酸对培养小鼠大脑皮层神经元的双重作用:抗凋亡和促凋亡

应用DNA电泳分析、HO33342和TUNEL染色法、以及部分地使用透射电镜技术,检测了不同浓度的溶血磷脂酸(1ysophosphatidic acid,LPA)对离体培养的小鼠大脑皮层神经元存活情况的影响.结果显示,低浓度的LPA(0.1～30μmol/L)对去血清培养所致的皮层神经元凋亡有浓度依赖性的保护作用,而较高浓度的LPA(＞50 μmol/L)不仅不表现这种保护作用,而且可引致培养在含血清的完全培养基中的皮层神经元出现凋亡.以上结果表明,适当浓度的LPA对凋亡的皮层神经元起着保护因子或抗凋亡因子的作用,而较高浓度的LPA则起着促凋亡因子的作用.     

雌激素处理的hBMSC对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用*

目的: 探讨雌激素处理人骨髓间充质干细胞(hBMSC)对高糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用及机制。方法: 采用30 mmol/L葡萄糖刺激hBMSC细胞建立高糖模型并分组:以无刺激者为高糖对照组(HG组)、以20 μmol/L雌激素处理者为高糖雌激素组(HG+E2组)、以5 μmo/L蛋白激酶B(PKB/Akt)抑制剂Triciribine预处理45 min后,再以20 μmol/L雌激素处理者为高糖Akt抑制剂组(HG+E2+Triciribine组)和正常条件培养的hBMSC为正常对照组(NG组)。分别于处理12 h后,采用CCK8法检测各组hBMSC的细胞活力,硝酸还原酶法和ELISA法检测各组培养基上清中NO、VEGF和IL-8的含量(n=6),48 h后采用Western blot检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白表达水平(n=3)。此外,提取各组hBMSC的培养基上清作为条件培养基(CM)培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)并分组为:HG-CM组(HG组条件培养基处理)、HG+E2-CM组(HG+E2组条件培养液处理)、HG+E2+Triciribine-CM组(HG+E2+Triciribine组条件培养基处理)和HG-H组(高糖对照组,30 mmol/L葡萄糖终浓度处理),分别于12 h后,采用CCK8法检测各组HUVEC的细胞活力(n=6),24 h后采用流式细胞术检测各组HUVEC细胞的凋亡率(n=3);48 h后采用划痕实验观察各组HUVEC细胞的迁移率(n=3)。结果: 与NG组相比,HG组中hBMSC细胞活力和细胞内eNOS蛋白磷酸化水平降低(P<0.05),细胞培养液上清中NO、VEGF和IL-8含量减少(P<0.05);与HG组相比,HG+E2组中hBMSC的细胞活力和细胞中eNOS蛋白磷酸化水平显著增加(P<0.05),细胞培养基上清中NO、VEGF和IL-8含量增加(P<0.05),而当hBMSC细胞中Akt蛋白活性被抑制后,HG+E2+Triciribine组中上述结果指标呈反向变化(P<0.05)。此外,与HG-CM组相比,HG+E2-CM组中HUVECs的细胞活力和迁移能力显著增加(P<0.05),细胞凋亡比例降低(P<0.05),而与HG+E2-CM组相比,HG+E2+Triciribine-CM组中HUVECs的细胞活力和迁移能力降低(P<0.05),细胞凋亡比例增加(P< 0.05)。结论: 雌激素可能通过激活hBMSC细胞Akt/eNOS信号通路,促进NO、VEGF和IL-8的分泌,进而增加HUVECs的细胞活力和迁移能力,并抑制细胞凋亡的发生,对高糖诱导的HUVECs细胞损伤发挥保护作用。     

缺氧诱导因子-1α调节叉头框蛋白1表达促进大鼠外周血间充质干细胞缺氧存活

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是再生医学中临床使用最多的干细胞之一。外周血间充质干细胞(peripheral blood mesenchymal stem cells, PBMSCs)以其获取简便、创伤小和具有多向分化能力等优势,在人类缺血性疾病的治疗方面具有重要应用前景。但尚未建立在缺氧环境下,使PBMSCs高存活和高扩增培养方法。本研究旨在探讨HIF-1α(hypoxia-inducible factor -1α, HIF-1α)通过调节叉头框蛋白1(forkhead box C1, FoxC1)表达,促进PBMSCs缺氧存活和扩增的作用。采取SD大鼠外周血,分离出单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),培养第3代后得到MSCs,随机将细胞进行以下3种处理,并分组:未处理组(Control, CON)、HIF-1α激动剂组(dimethyloxallyl glycine, DMOG,0.1 mmol/L,DMOG组)和HIF-1α抑制剂组(BAY87-2243,50 nmol/L,BAY组),进行缺氧培养PBMSCs,观察各组不同时间点(1 h、10 h、20 h、30 h、40 h、50 h、60 h、70 h、80 h)PBMSCs凋亡和增殖情况。应用qRT-PCR和Western 印迹观察细胞FoxC1表达情况,及抗凋亡分子Bcl2和凋亡信号分子Bax和胱天蛋白酶3(caspase3)表达情况。MNCs经过3代培养后,可得到纯度较高的PBMSCs。但是,这些细胞在体外缺氧培养30 h即发生凋亡,但经HIF-1α激动剂DMOG能抑制其凋亡,能使PBMSCs缺氧延长到60 h以上。与CON组比较,DMOG处理使DMOG组PBMSCs活力升高2.6倍(P<0.001),细胞老化率(SA-β-gal阳性细胞百分率)降低70.1%(P<0.001),细胞凋亡率(Annexin V+PI+细胞百分率)减少64.6%(P<0.001)。加入HIF-1α抑制剂BAY87-2243则引起相反的变化:培养20 h后细胞增殖能力明显减弱,与CON组比较,BAY组细胞活力明显下降(P<0.001),老化率增加35.6%(P<0.001),细胞凋亡率增加38.1%(P<0.001)。进一步研究发现,DMOG可上调HIF-1α表达,促进FoxC1表达(DMOG组较CON组升高2.3倍,P<0.001),上调抗凋亡蛋白Bcl2(DMOG组较CON组升高3.8倍,P<0.001)、下调凋亡蛋白Bax和胱天蛋白酶3表达(各下降86.5%和85.0%,均P<0.001),而加入BAY87-2243显著降低HIF-1α、FoxC1和Bcl2表达,上调Bax和胱天蛋白酶3表达(与CON组比较,均P<0.001)。由此可见,HIF-1α-FoxC1是影响MSCs缺氧存活和增殖的重要信号途径,这有助于提高PBMSCs在缺氧环境中存活和扩增。     

三七总皂苷对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的抑制作用北大核心CSCD

本文旨在研究三七总皂苷(total saponins of Panax notoginseng,t PNS)对二氯化钴(CoCl_2)诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,r BMSCs)凋亡的抑制作用及机制。采用密度梯度离心法分离SD大鼠BMSCs。不同浓度t PNS(1、10和100μg/m L)处理r BMSCs 48 h后,行流式细胞术检测细胞增殖(Ed U法)和细胞周期。300μmol CoCl_2孵育细胞24 h诱导凋亡,在CoCl_2处理的同时加入不同浓度t PNS(1、10和100μg/m L)。Annexin V-FITC/PI染色后,用流式细胞仪检测细胞凋亡率;罗丹明123染色后,在荧光显微镜下观察线粒体膜电位改变;q RT-PCR检测细胞Bcl-2家族的基因表达。结果显示,t PNS各浓度组细胞增殖率均较对照组升高,100μg/m L t PNS组G2+S期细胞百分比较对照组升高。与对照组相比,CoCl_2组细胞凋亡率增加14.2%,而t PNS三个浓度组细胞凋亡率分别较CoCl_2组减少14.4%、12.8%和13.9%(均P<0.01)。与对照组相比,CoCl_2组线粒体膜电位明显降低,而t PNS各浓度组膜电位降低程度明显低于CoCl_2组。t PNS各浓度组的Bcl-2和Bcl-xl m RNA表达均高于CoCl_2组(均P<0.05);10和100μg/m L t PNS组的Bax/Bcl-2比值较CoCl_2组显著降低。以上结果提示,t PNS对CoCl_2诱导的r BMSCs凋亡有抑制作用,其机制是通过提高细胞线粒体膜电位,上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达,降低Bax/Bcl-2比值而实现的。     

缺氧复氧诱导脐静脉内皮细胞凋亡的机制

目的探讨缺氧复氧诱导人脐静脉内皮细胞凋亡发生的机制.方法体外培养人脐静脉内皮细胞,随机分为5组:缺氧0h(对照组)、3h、6h、12h、24h复氧组.向培养瓶内通入95%N2和5%CO2按不同时间孵育,随后通入5%CO2和95%空气复氧2h,建立内皮细胞缺氧复氧模型.采用台盼蓝染色、TUNEL技术对凋亡和死亡细胞进行定量分析,DNA电泳观察内皮细胞凋亡的形态学.Western blot检测细胞凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax表达强度,同时检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中磷酸化ERK1/2的表达.采用凝胶成像分析系统灰度扫描检测蛋白质表达相对量.结果缺氧复氧后内皮细胞凋亡明显,而且内皮细胞凋亡数随缺氧时间延长而增多(P<0.05).Western blot表明缺氧复氧增强内皮细胞Bax的表达,对Bcl-2的表达量和磷酸化ERK1/2没有明显影响,使Bcl-2/Bax比值减小.结论缺氧复氧可以诱导内皮细胞凋亡,证实缺氧复氧上调促凋亡蛋白Bax的表达,对抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达无显著影响.首次证实缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡是取决于Bcl-2/Bax比值,而不是通过MAPK磷酸化途径.