外源丙氨酸提高蜘蛛牵引丝蛋白天然基因在原核系统中的表达

蜘蛛丝蛋白天然基因的体外表达受诸多因素的限制。本研究在获得生长于中国的Nephila clavipes蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA（Genbank Accession No. AF441245）的基础上,利用限制性内切酶双酶切反应构建含有Spidroin2 cDNA的重组表达质粒pET-28b(+)-Sp。将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞感受态菌中,以不同浓度的IPTG进行诱导,并通过诱导时间、培养温度、加入外源丙氨酸等途径提高Spidroin2 cDNA的表达量,同时利用多克隆抗体对表达产物进行Western blot检测。重组质粒pET-28b(+)-Sp的测序结果表明Spidroin2 cDNA基因以正确的阅读框插入到原核表达载体中;SDS-PAGE结果表明菌体表达蛋白中存在着大小约为31 kDa的目的蛋白带（加入外源丙氨酸条件下）,Western blot检测结果进一步证实,目的基因在大肠杆菌中得到正确表达。本研究证实,蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA可在原核细胞内正确表达,外源丙氨酸的加入对于提高天然蜘蛛丝蛋白基因在原核系统的表达作用明显。     

人精子蛋白17放射诱导表达细胞模型的构建

目的:构建pEgr-Sp17重组质粒,并检测其在人卵巢癌细胞系HO8910中的辐射诱导表达,探索Egr-1基因调控序列辐射诱导下游基因表达的功能,建立放射诱导表达人精子蛋白Sp17的细胞模型。方法:用双酶切、粘端连接的方法构建含有辐射诱导特性的早期反应因子Egr-1和人Sp17基因的pEgr-Sp17重组质粒,利用脂质体介导其转染人HO8910细胞,用免疫细胞化学方法检测X线照射后被转染细胞中Sp17的表达。在确证Sp17能瞬时表达后,继续用含G418的RPMI1640培养基培养细胞,筛选稳定表达Sp17的细胞株。结果:测序结果和酶切鉴定均证实pEgr-Sp17重组质粒构建正确;免疫细胞化学试验表明pEgr-Sp17重组质粒转染的人HO8910细胞表达Sp17蛋白。结论:X线可诱导pEgr-Sp17重组质粒在人HO8910细胞中表达Sp17蛋白,构建了Sp17蛋白放射诱导表达的卵巢癌细胞模型。     

中国林蛙核糖核酸酶Rdrlec新基因的原核可溶表达

来源于蛙属的核糖核酸酶由于具有显著的抗肿瘤活性而备受关注,Rdrlec是从中国林蛙基因组中克隆得到的核糖核酸酶新基因。获得大量高纯度野生型重组蛋白是研究其功能的基础。按照大肠杆菌偏好的密码子人工合成Rdrlec基因,通过EcoR I和Hind III位点插入到表达载体pET-32a(+)中构建pET32-Rdrlec重组表达质粒,转化到Escherichia coli BL21(DE3)中,0.4 mmol/L IPTG 30℃诱导6 h后,融合蛋白主要以可溶形式表达,经过Ni-NTA亲和纯化和Sephadex G75层析纯化,得到电泳纯融合蛋白。肠激酶切割后得到Rdrlec野生型重组蛋白,具有降解RNA的酶活性,证明分子的空间结构已经正确形成。Rdrlec野生型重组蛋白表达成功,为后续蛋白结构与功能的研究以及进一步的开发应用提供了原料。     

原核生物核糖核酸酶HII基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

核糖核酸酶HII (RNaseHII)能有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链。为进一步研究其功能 ,利用大肠杆菌XL1blue为模板 ,相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,PCR扩增大肠杆菌RNaseHII(rnh 2 )基因 ,并将目的基因连接到克隆载体 pUC18上 ,经测序确认无误 ,分别亚克隆到能够进行IPTG诱导的表达载体pTrcHisC和进行温度诱导的表达载体pBV2 2 0上。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中获得高效表达。在载体pTrcHisC和 pBV2 2 0中目的蛋白RNaseHII的表达量均超过菌体总蛋白的 2 0 % ,且表达产物以稳定的包涵体形式存在。此项工作为以后目的蛋白的纯化提供了有利条件 ,并为研究其结构和功能奠定了基础。     

中国林蛙Onconase样核糖核酸酶的基因克隆和表达

Onconase是从美洲豹蛙卵中提取的一种核糖核酸酶,由于其抗肿瘤活性而具有潜在的临床应用价值.以中国林蛙基因组为模板,克隆了一个新的RNase基因,并由此推导出了成熟林蛙RNase的氨基酸顺序.该酶是由103个氨基酸残基组成的,它保留了RNaseA家族成员酶催化活性必须的组氨酸和赖氨酸残基,以及CKXXNTF的序列特征,与Onconase具有73％的氨基酸顺序的相似性.林蛙酶比Onconue少一个氨基酸,成为选今为止发现的RNaseA家族中的最小成员;并且,林蛙酶拥有的精氨酸和酪氨酸残基比Onconase多3个.此外,在利用原核表达系统对林蛙RNase基因进行表达的过程中,表达产物对宿主显示出一定的细胞毒性.     

Barnase在大肠杆菌中的分泌表达和诱导条件优化

从解淀粉芽孢杆菌中PCR分别扩增解淀粉芽孢杆菌核糖核酸酶barnase基因及其抑制剂barstar基因,采用将barnase基因置于barstar基因保护下的克隆策略,以pET-22b（＋）质粒为基础,构建大肠杆菌分泌型表达质粒．IPTG诱导表达目的蛋白后将培养基蛋白进行SDS-PAGE分析并从诱导温度、IPTG诱导浓度和诱导时间三方面初步优化诱导表达条件．     

N端融合不同长度转位肽的重组粒酶B抑制细胞生长作用的比较

采用重组PCR法将粒酶B基因的N端信号肽和酸性二肽编码序列去除,与两种不同长度的绿脓杆菌外毒素（PE）转位肽序列分别连接,将它们插入pIND诱导表达载体,通过脂质体法与pVgRXR辅助质粒共转染HeLa细胞,建立了重组PE II-GrBa基因的诱导表达细胞系。松甾酮A诱导后Western印迹检测到目的基因的表达,间接免疫荧光观察到表达细胞出现多核巨细胞的异常形态。两种表达的PE II-GrBa融合蛋白均能够切割粒酶B的细胞内源性和外源性底物,并且使细胞生长速度减慢。其中,PE II-(aa 280358)-GrBa的底物切割能力和生长抑制作用较强。流式细胞仪分析这种抑制作用可能与细胞周期的G2期受到阻遏有关。上述结果证实了PE II-GrBa融合蛋白仍然具有抑制细胞生长的作用,并且较短的转位肽对GrBa活性的影响较小,有助于进一步优化转位肽/细胞毒性效应蛋白重组分子的结构用于肿瘤细胞杀伤。     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因表达条件的优化

目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实重组质粒pXSL1含有ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,以IPTG为诱导剂诱导ST1-LTB融合基因表达的优化条件是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时ST1-LTB融合蛋白表达量达35.2%。结论:实现ST1-LTB融合基因的高效表达,为大肠杆菌肠毒素双价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的实验数据。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达人vasorin(VASN)蛋白。方法:利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61×103的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论:获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

Secretory expression of arginine deiminase in E.coli

将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arcA克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢ B中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI.将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F’后进行诱导表达,分别考察了不同诱导物L-arabinose浓度、诱导温度、诱导时间对重组蛋白表达的影响,最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002％ (w/v),25℃下诱导5h,全细胞的酶活为68 mU/mL(指单位发酵液体积,下同).采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL.SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kD.