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胰岛素原C肽多聚体基因在大肠杆菌中的表达及重组C肽在水溶液中的稳定性 总被引:1,自引:0,他引:1
合成了胰岛素原C肽三聚体的基因,并在大肠杆菌中得到高效表达。表达的融合蛋白质通过设计的特异性位点的酶切得到重组的人胰岛素原C肽单体。融合蛋白质以可溶性蛋白质的形式表达,表达量约为80mg/L。Ni—NTA亲和柱可有效地从细胞裂解的上清液中分离纯化融合蛋白质,得到纯度大于70%的融合蛋白质37.5mg/L。融合蛋白质可经胰蛋白酶/羧肽酶B双酶切有效释放天然的C肽。释放的C肽经氨基酸组成分析、与标准对照的RP—HPLC分析和免疫发光法定量证实与天然人C肽完全相同。C肽经RP-HPLC纯化后可得,总的收率为1.5mg/L,纯度大于95%。考察了C肽在冻干过程中及在水溶液中的稳定性。结果表明C肽在冻干过程中稳定,在水溶液中其稳定性受pH和温度的影响。在pH3和pH7.4缓冲液中,37℃或70℃下,C肽的降解符合一级动力学。C肽冻干品直接溶解于pH9的缓冲液中,立即降解,降解产物在37℃和70℃下基本稳定。C肽冻干品直接溶解于pH3的缓冲液中,立即发生降解反应,随后可观察到随温度升高和时间延长,降解反应的进行,37℃、10h,可观察到约80.3%的C肽保持,而在70℃、10h,只有43%C肽保持。C肽在pH7.4最稳定,37℃、6h或10g/L BSA存在下,70℃、3h,未观察到降解产物。PH7.4、37℃、10h,在有和没有10g/L BSA存在的情况下,C肽的保持率分别为99%和96%,从而显示了BSA的保护作用。 相似文献
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降纤酶是从长白山白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇毒中提取的单一成分蛋白水解酶,属蛇毒类凝血酶。1997年部颁标准采用以纤维蛋白原为底物,0.04mol/LTris-HCl(pH值7.4,含0.02mol/LNaCl)缓冲液溶解稀释纤维蛋白原、降纤酶标准品和供试品,通过测定降纤酶促凝活性来测定其效价[1]。 在降纤酶生产和质量检验过程中,曾出现冻干成品核检效价比未冻干前半成品效价降低50%左右,严重影响到生产的管理和产品质量控制。为此,我们通过对降纤酶溶液pH值、NaCl浓度和冻干过程中温度、时间的控制等可能影响效价因素进行逐一排查,发现NaCl浓度是影响降纤酶效价… 相似文献
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水/有机溶剂双相中固定化啤酒酵母细胞催化有机硅酮不对称还原 总被引:6,自引:0,他引:6
研究了水/有机溶剂双相中,固定化啤酒酵母细胞催化三甲基硅乙酮不对称还原成(-)-1-三甲基硅乙醇的反应,系统探讨了振荡速度、有机溶剂疏水性、水相与有机溶剂相体积比、水相pH值和反应温度对反应速度、产率和产物光学纯度的影响.结果表明,上述因素对固定化啤酒酵母细胞催化三甲基硅乙酮不对称还原反应均有较显著的影响.正己烷为该反应最好的有机溶剂,振荡速度以150 r/min为宜,水相与有机溶剂相体积比以1∶2较佳,适宜的pH值为8,最佳反应温度为25~30℃.在该优化反应条件下,反应最大产率和产物的光学纯度分别高达96.8%和95.7%(ee). 相似文献
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大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及其纯化保存策略 总被引:4,自引:0,他引:4
编码完整大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的基因被引入pET11c形成pET11-LT,该质粒在E.coli BL21(DE3)中得到较高效率的表达,约46mg/L。用D(+)Immobilized galactose柱可以在很宽的pH范围(pH7.3~10.4)内用多种方法对LT进行纯化且保持其结构完整。溶于TEAN(pH7.3)或碳酸盐缓冲液(pH10.4)的LT,冻干后保存于4℃,可长久保持其完整结构,此为保存LT的较好策略。与GM1结合实验、CHO细胞及Patentmouse毒性检测实验证明纯化的LT具有生物学活性。 相似文献
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研究了微水-有机溶剂两相体系中固定化脂肪酶催化的萘甲酯的立体选择性水解反应,固定化酶活性受载体极性、水含量、有机溶剂的logP值,产物抑制的影响,据此构建了一种可以连续拆分产生(S)-(+)-萘普生的微水-有机溶剂两相体系。反应在一个具有回路的连续流搅拌反应器中进行,反应器中添加有采用吸附法固定化的脂肪酶,截体为一种弱极性的合成载体,水相连同固定化酶颗粒一起永久保持在反应器中,有机流动相带入底物, 相似文献
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利用微生物转化富含蛋白质的浮萍生产蛋白酶,为浮萍的高值化利用开辟一条新途径。在摇瓶转化的基础上,探索在5L发酵罐上沙雷氏菌(Serratiasp.)SYBC H转化浮萍生产蛋白酶的最佳转化条件。通过对温度、通风量、搅拌转速、pH等参数的研究,发现在5L发酵罐上,沙雷氏菌SYBC H转化浮萍生产蛋白酶的最佳条件为通风量6vvm,搅拌转速400r/min,发酵温度30℃。转化过程中,采用全自动控制pH值(9.0),蛋白酶的产量比不控制pH的对照组提高了23.3%。进一步研究发现,利用微生物沙雷氏菌SYBC H转化浮萍生产的蛋白酶具有耐有机溶剂的特性,在某些亲水性有机溶剂中保留90%以上的活性,是一种稀少珍贵的极端酶。 相似文献
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芽胞杆菌(Bacillus sp.)YX-1耐有机溶剂葡萄糖脱氢酶的基因克隆与酶学性质 总被引:1,自引:1,他引:0
[目的] 从芽胞杆菌(Bacillus sp.)YX-1基因组中克隆出一种有机溶剂耐受型的葡萄糖脱氢酶基因,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,研究了重组蛋白的酶学性质.[方法] 依据芽胞杆菌属中葡萄糖脱氢酶氨基酸序列的保守性,设计合理引物,钓取来源于Bacillus sp.YX-1的葡萄糖脱氢酶基因,构建诱导型表达载体pET28a-gdh,于大肠杆菌中进行表达.镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,考察了重组蛋白的酶学性质.[结果] 葡萄糖脱氢酶基因全长为786 bp,编码261个氨基酸.酶学研究结果表明:该酶最适反应温度为45℃,最适pH值为8.0;具有良好的有机溶剂耐受性,于50%的辛烷、环己烷、癸烷中室温放置1h后,酶活仍能保持90%以上;具有较宽的底物谱,对多种糖均具有一定的催化活性,其中催化D-葡萄糖的活力最高,产生还原型辅酶因子;对辅酶NADH和NADPH具有相似的依赖性,对NAD+和NADP+的催化比活分别为8.37 U/mg和8.62 U/mg.[结论]利用生物信息学成功地挖掘出Bacillus sp.YX-1一种耐有机溶剂的葡萄糖脱氢酶,为氧化还原酶在有机相反应中的的辅酶再生循环提供了新型的生物催化剂. 相似文献