乙型肝炎病毒X蛋白调节TRAIL诱导的肝细胞凋亡

观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)诱导肝细胞凋亡的影响并初步探讨其分子机制. 构建包含HBx基因的真核表达载体pcDNA-HBx, 转染BEL7402肝癌细胞, 建立可稳定表达HBx的肝癌细胞系BEL7402-HBx, 同时设立空载体pcDNA3转染对照组细胞BEL7402-cDNA3. 台盼蓝染色计数, Caspase3活性检测和TUNEL法检测TRAIL诱导BEL7402, BEL7402-cDNA3, BEL7402-HBx细胞凋亡的情况, 并通过流式细胞术分析3组细胞表面TRAIL受体的表达水平. 此外, 利用硫代反义寡核苷酸封闭HBV全基因转染肝癌细胞系HepG2.2.15中HBx蛋白的表达, 观察阻断前后对TRAIL诱导凋亡敏感性的改变, 进一步反向验证HBx对TRAIL诱导凋亡的调节作用. 台盼蓝染色计数提示TRAIL 对BEL7402, BEL7402-cDNA3, BEL7402-HBx均有剂量依赖性的细胞毒作用, 但在相同浓度TRAIL作用下, BEL7402-HBx细胞较BEL7402, BEL7402-cDNA3细胞有更高的敏感性. Caspase3活性检测结果分析发现, TRAIL作用后BEL7402-HBx细胞在较短时间内有更高的Caspase3活化水平. TUNEL结果显示, 10 mg/LTRAIL作用下, BEL7402-HBx细胞凋亡率可达(41.4±7.2)%, 显著高于对照组细胞. 反义封闭HepG2.2.15细胞中HBx基因的表达可部分阻断TRAIL诱导的凋亡. 两组实验结果均显示HBx的表达变化并不影响细胞表面TRAIL受体的表达模式. HBx蛋白参与调节TRAIL诱导的细胞凋亡, 可能在HBV相关疾病的发生中起一定作用, 这一作用与TRAIL受体表达水平无关. 从两个不同的侧面证实了HBx对TRAIL诱导细胞凋亡的调节作用, 为进一步论证凋亡失衡在HBV感染相关肝炎及肝癌发生中的作用提供了新的论据.     

长链非编码RNA MALAT1对弥漫性大B细胞淋巴瘤增殖、凋亡的影响

为了探讨长链非编码RNA MALAT1在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)疾病中的作用及可能的分子机制,该研究在体外培养DLBCL细胞系SU-DHL-1和SU-DHL-4,并过表达或敲低MALAT1,应用实时荧光定量PCR实验分析各组细胞中MALAT1的表达水平,用CCK-8实验和BrdU掺入实验分析细胞增殖活性,用Annexin V/PI双标记实验检测细胞凋亡水平,用蛋白质免疫印记实验分析β-catenin信号通路的活性调控。结果发现,与Control组相比过表达MALAT1,DLBCL细胞中MALAT1的表达显著提高(P0.001),细胞增殖活性显著升高(P0.05),BrdU阳性细胞比例显著升高(P0.01)。与转染对照siRNA组细胞相比,转染MALAT1 siRNA组细胞MALAT1表达水平显著下降(P0.01),细胞增殖活性显著下降(P0.01),BrdU阳性细胞比例显著下降(P0.001),细胞晚期凋亡比例显著升高(P0.001)。蛋白质免疫印记结果显示,过表达MALAT1促进了GSK3β的磷酸化及β-catenin的活化,而敲低MALAT1则降低了GSK3β的磷酸化及β-catenin的活化。这些实验数据表明,MALAT1可促进DLBCL细胞的增殖,抑制细胞凋亡,影响细胞β-catenin信号通路的活化。     

PIAS3α过表达对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究过表达PIAS3α蛋白对人前列腺癌细胞系DU145细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法 构建pcDNA3.1(+)-HA-PIAS3α真核表达载体,转染前列腺癌细胞系DU145,以蛋白免疫印迹实验检测外源PIAS3α的表达,通过MTT法检测细胞增殖,以流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡.结果 成功构建PIAS3α真核表达质粒,蛋白免疫印迹实验证实外源性PIAS3蛋白质DU145细胞中获得表达.分析目的 蛋白质过表达后的细胞生物学效应,结果显示在DU145细胞中过表达PIAS3α后,细胞增殖受到抑制;同时,细胞周期G0/G1期细胞显著增加,而S期细胞减少,细胞凋亡比率增加.结论 过表达PIAS3α抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡.     

葡萄籽原花青素对人骨肉瘤143B细胞的作用及机制研究

该文研究葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins,GSP)对人骨肉瘤143B细胞增殖、凋亡的影响及其机制。用不同剂量GSP处理骨肉瘤143B细胞,结晶紫染色和集落形成试验分别用于检测细胞增殖和集落形成能力的变化;流式细胞术检测细胞周期与凋亡,Western blot法检测周期和凋亡相关蛋白;RT-PCR和Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路相关分子表达的变化;采用腺病毒Adβ-catenin感染以过表达β-catenin,探讨GSP抑制143B细胞增殖的作用是否与Wnt/β-catenin信号通路相关。结果显示,GSP在20~60μg/m L剂量范围内呈剂量和时间依赖性抑制143B细胞增殖活力和降低细胞克隆形成能力;GSP引起G0/G1周期阻滞和周期相关蛋白cyclin D1下调,还使细胞凋亡率明显增高,并伴有活化的凋亡相关蛋白cleaved PARP(poly ADP-ribose polymerase)和cleaved caspase-8的水平增高;GSP降低143B细胞中β-catenin m RNA水平及核内与总β-catenin蛋白质水平,抑制GSK3β磷酸化并上调GSK3β蛋白质水平;过表达β-catenin可部分减弱GSP对该细胞增殖活性的抑制作用。结果表明,GSP抑制骨肉瘤143B细胞的增殖和促进其凋亡,其机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的抑制。     

过表达SGK3肝癌细胞BEL-7402在去甾体激素血清中的抗凋亡研究

目的:构建过表达血清与糖皮质激素调节激酶3(SGK3)的质粒以及稳定表达SGK3的肝癌细胞系BEL-7402,研究其在去甾体激素胎牛血清(FBS)中的抗凋亡能力。方法:PCR扩增SGK3基因,将扩增产物连接到p CDH载体,构建出p CDH-SGK3的慢病毒载体质粒,将其同空白对照p CDH-NC分别与慢病毒包装载体共转入293T细胞,包装成慢病毒p CHD-SGK3和p CDH-NC;将构建的慢病毒感染肝癌细胞BEL-7402并用嘌呤霉素筛选,Western印迹检测SGK3的表达;观察细胞在FBS及去甾体激素FBS中的生长情况。结果:包装出p CDH-SGK3重组慢病毒,此慢病毒感染肝癌细胞系BEL-7402后获得表达;CCK8实验表明过表达SGK3可促进肝癌细胞的生长,BEL-7042细胞中有雄激素的表达,去甾体激素FBS中细胞生长受到抑制,过表达SGK3可增强肝癌细胞在去甾体激素血清中的抗凋亡能力。结论:在肝癌细胞BEL-7402中过表达SGK3可促进细胞生长,可增强细胞在去甾体激素FBS中的抗凋亡能力。     

飞燕草素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌的机制研究

为研究飞燕草素对乳腺癌MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响。免疫组化检测裸鼠乳腺肿瘤组织和肺组织转移瘤Ki-67及乳腺肿瘤组织蛋白水解酶超家族基质金属蛋白酶-7(matrix metallopeptidase 7,MMP-7)的表达水平;Western blot检测移植瘤Wnt/β-catenin通路β-联蛋白(β-catenin)、磷酸糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)及通路下游细胞周期相关蛋白cyclinD1、原癌基因c-myc和MMP-7的蛋白水平表达,体内外实验发现飞燕草素不仅能抑制裸鼠异种移植瘤生长及乳腺癌肿瘤组织和肺组织转移瘤Ki-67表达还可以明显降低乳腺癌MDA-MB-231细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin和p-GSK-3β下游靶基因c-myc、cyclin D1和MMP-7蛋白的表达。本研究证实飞燕草素能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,发挥抑制乳腺癌的作用。     

SIRT2对裸鼠原位肝癌生长和肺转移的影响及其机制研究

该文旨在探讨沉默信息调节因子2(silent information regulator 2,SIRT2)基因敲低对裸鼠原位肝癌生长和肺部转移的影响。应用杀稻瘟菌素筛选构建稳定敲低SIRT2基因的SK-Hep-1细胞,应用定量逆转录PCR(q RT-PCR)和Western blot检测其敲低效率。将稳定敲SIRT2基因的细胞(SIRT2-sh RNA-SK-Hep-1)和对照组细胞(sh Cont-SK-Hep-1)原位注入裸鼠肝脏,8周后处死裸鼠并取出肝脏和肺组织,比较两组裸鼠肝癌肿瘤的大小及肺转移结节的数量。应用Western blot和免疫组织化学检测两组裸鼠肝癌组织中SIRT2、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β、activeβ-catenin和β-catenin的蛋白质水平。结果显示,稳定敲低SIRT2基因的SK-Hep-1细胞系构建成功。裸鼠原位肝癌肺转移模型中,相比sh Cont-SK-Hep-1组,SIRT2-sh RNA-SK-Hep-1组裸鼠原位肝癌体积减小(P0.05),肺转移结节数量明显减少(P0.05)。Western blot结果表明,敲低SIRT2基因的裸鼠组p-AKT、p-GSK3β、activeβ-catenin、β-catenin蛋白质水平降低,GSK3β水平升高,AKT水平无差异;免疫组织化学结果表明,敲低SIRT2基因的裸鼠组p-AKT、p-GSK3β、β-catenin蛋白质水平降低。本研究结果提示,在裸鼠原位肝癌肺转移模型中,敲低SIRT2基因可以通过激活AKT的表达影响GSK3β/β-catenin信号通路,从而抑制人肝癌细胞的生长和肺转移。     

HepaCAM通过Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞T24的增殖

该研究探讨了肝细胞黏附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,Hepa CAM)对膀胱癌细胞T24增殖的影响及其对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。T24细胞做空白处理、空载腺病毒(Ad-GFP)处理和Hepa CAM过表达腺病毒(Ad-GFP-Hepa CAM)处理,CCK-8法检测Hepa CAM对细胞增殖的影响,q RT-PCR和Western blot法检测Hepa CAM对β-catenin、c-Myc和cyclin D1的m RNA和蛋白表达水平的影响。采用Wnt/β-catenin信号通路激活剂Li Cl处理T24细胞,MTT法检测细胞增殖能力,Western blot检测GSK3β(try216)磷酸化水平及β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白水平,克隆形成试验检测细胞的克隆形成能力。结果显示,过表达Hepa CAM后,能够抑制T24细胞的生长,下调β-catenin、c-Myc及cyclin D1的m RNA和蛋白的表达水平。5,10,20μmol/L的Li Cl作用细胞2 h后,均可促进T24细胞的增殖。10μmol/L的Li Cl作用2 h后能够降低GSK3β的磷酸化水平,促进Wnt信号通路的活化。10μmol/L的Li Cl与Ad-GFP-Hepa CAM联合处理细胞后,能够逆转Hepa CAM对β-catenin、c-Myc及cyclin D1蛋白水平和细胞增殖的抑制作用。该研究表明,Hepa CAM可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞T24的增殖。     

Wnt5a通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路调控人卵巢癌SKOV3/VCR细胞对长春新碱的敏感性

本研究旨在探究Wnt5a对人卵巢癌SKOV3细胞长春新碱(vincristine, VCR)耐药性的影响,并探讨其分子机制。采用浓度梯度递增法构建耐药株SKOV3/VCR细胞,将人WNT5A基因的干扰质粒转染SKOV3/VCR细胞并筛选出稳定干扰Wnt5a的细胞株,用RT-PCR检测Wnt5a的mRNA表达水平,用CCK-8法检测细胞活力,用流式细胞术检测细胞凋亡,用Western blot法检测Wnt5a、MDR1、Survivin、β-catenin、Akt、p-Akt(S473)、GSK3β和p-GSK3β(Ser9)的蛋白表达水平。结果显示,SKOV3/VCR细胞中Wnt5a、MDR1、β-catenin和Survivin蛋白的表达水平、Akt和GSK3β蛋白的磷酸化水平以及Wnt5a mRNA表达水平均显著高于其亲代SKOV3细胞;WNT5A基因沉默使VCR抑制SKOV3/VCR细胞活力的IC50从38.412降至9.283 mg/L,提高SKOV3/VCR细胞凋亡率并协同增强VCR诱导的细胞凋亡(P 0.05),下调MDR1、β-catenin和Survivin蛋白的表达水平(P 0.05),抑制Akt和GSK3β蛋白磷酸化(P 0.05);此外,PI3K抑制剂LY294002也可下调SKOV3/VCR细胞中MDR1、β-catenin和Survivin蛋白表达水平,并降低Akt和GSK3β蛋白磷酸化水平(P 0.05)。以上结果提示,沉默WNT5A基因可在体外逆转人卵巢癌耐药株SKOV3/VCR细胞耐药性,作用机制可能与其抑制PI3K/Akt/GSK3β/β-catenin通路,继而下调MDR1和Survivin蛋白表达有关。     

间充质干细胞释放 Dkk-1 抑制乳腺癌细胞 Wnt/β-catenin 途径的实验研究

研究表明,间充质干细胞具有向肿瘤细胞定向迁移并且抑制肿瘤细胞的特性,然而其分子机理目前尚不清楚.为了探讨间充质干细胞抑制肿瘤细胞作用的分子机制,应用BMMS-03人间充质干细胞的条件培养液作用于MCF-7乳腺癌细胞,通过软琼脂克隆形成实验、MTT实验、免疫印迹和免疫荧光染色等技术观察细胞克隆形成、增殖和基因表达的变化.结果显示:在BMMS-03细胞条件培养液作用下,MCF-7细胞的克隆形成和增殖受到了明显的抑制,β-catenin及其下游靶蛋白c-Myc、Bcl-2、PCNA和survivin的表达被明显下调,MCF-7细胞浆和细胞核内β-catenin的表达被明显抑制.BMMS-03细胞中Dkk-1的表达水平与MCF-7细胞相比较高.利用抗Dkk-1的抗体中和BMMS-03细胞条件培养液中的Dkk-1后,可明显拮抗BMMS-03细胞条件培养液对MCF-7细胞中β-catenin及c-Myc表达的抑制作用,基因转染使MCF-7细胞过表达Dkk-1后,MCF-7细胞的β-catenin及c-Myc的表达明显下调.同样经基因转染使BMMS-03细胞过表达Dkk-1后,其条件培养液可进一步下调MCF-7细胞β-catenin及c-Myc的表达.上述结果表明,间充质干细胞BMMS-03对乳腺癌MCF-7细胞的恶性表型具有明显抑制作用,其分子机制与间充质干细胞释放Dkk-1抑制乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号途径有关.     

乙肝病毒X蛋白通过β-catenin通路调控肝癌细胞增殖、细胞周期的研究

乙肝病毒X蛋白(HBx)是由乙型肝炎病毒(HBV)DNAX基因编码的蛋白,具有促癌作用且与乙肝相关肝癌的发生有关,但其发挥促癌作用的机制尚不清楚.在乙肝相关肝癌中,β-连环蛋白(β-catenin)通路过度激活并介导了促进细胞增殖、加速细胞周期的效应.为了观察HBx是否通过β-catenin通路调控肝癌细胞增殖、细胞周期,本实验培养肝癌Huh7细胞株并分为对照组、转染HBx质粒的HBx组、转染HBx并用β-catenin抑制剂ICG-001处理的HBx+ICG-001组、转染HBx并用β-catenin抑制剂XAV939处理的HBx+XAV939组,检测细胞增殖活力OD490nm、细胞周期及生存素(survivin)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、c-myc、β-catenin、磷酸型GSK-3β(p-GSK-3β)的表达量.结果显示,HBx组的OD490nm水平、细胞周期S期、G2/M期的比例、survivin、bcl-2、cyclinD1、c-myc、β-catenin、p-GSK-3β的表达量均高于对照组,细胞周期G0/G1期的比例低于对照组(P＜0.05);HBx+ICG-001 组、HBx+XAV939组的OD490nm水平、细胞周期S期、G2/M期的比例、survivin、bcl-2、cyclinD1、c-myc、β-catenin、p-GSK-3β的表达量均低于HBx组,细胞周期G0/G1期的比例高于HBx组(P＜0.05).结果表明,HBx促进肝癌细胞增殖、加速细胞周期的作用与激活β-catenin通路有关.本研究的创新之处在于阐明HBx促进肝癌细胞增殖、加速细胞周期的分子机制,激活β-catenin通路是介导HBx上述作用的分子机制之一,这也为今后乙肝相关肝癌的防治提供了新思路、新靶点.     

人乳头瘤病毒16 E6蛋白通过Wnt/β-catenin通路促进食管癌Eca109细胞增殖、迁移的实验研究

人乳头瘤病毒16(Human papillomavirus 16,HPV16)感染与食管癌的发生密切相关,HPV16编码的HPV16E6蛋白是主要的致癌蛋白,已经在宫颈癌细胞中被证实能够促进癌细胞的增殖、迁移,同时也可激活Wnt/β-catenin通路。但HPV16 E6蛋白对食管癌细胞增殖、迁移的调控作用及机制尚未阐明。为研究HPV16 E6蛋白对食管癌Eca109细胞增殖、迁移及细胞中Wnt/β-catenin通路的调节作用,本研究培养食管癌Eca109细胞并分组,空白对照组用不含药物及质粒的DMEM处理,空白pcDNA3.1组转染空白的pcDNA3.1质粒,HPV16 E6组转染HPV16 E6基因的pcDNA3.1质粒,HPV16 E6+XAV组转染HPV16 E6基因的pcDNA3.1质粒、同时加入β-catenin抑制剂XAV939;并检测细胞的增殖、迁移活力及细胞中增殖基因、迁移基因、Wnt/β-catenin通路基因的表达。结果显示,转染24h后,HPV16 E6组细胞的增殖活力、迁移活力以及细胞中c-myc、cyclinD1、bcl-2、HMGA-2、N-cadherin、Wnt2、β-catenin的蛋白表达量均明显高于空白对照组、空白pcDNA3.1组;HPV16 E6+XAV组细胞的增殖活力、迁移活力以及细胞中c-myc、cyclinD1、bcl-2、HMGA-2、N-cadherin、β-catenin的蛋白表达量均明显低于HPV16 E6组,Wnt2的蛋白表达量与HPV16 E6组比较无明显差异。本研究揭示,HPV16 E6蛋白能够促进食管癌Eca109细胞的增殖、迁移且该作用与激活Wnt/β-catenin通路有关。     

Rho GTPases对肿瘤血管生成相关分子的作用

探讨RhoGTPases的 3个主要分子RhoA、Rac1和Cdc4 2对肿瘤血管生成相关分子的作用 .构建负显性RhoA、Rac1和Cdc4 2的真核表达质粒 ,在Lipofectamine2 0 0 0 介导下转染胃癌细胞AGS ,应用ELISA检测细胞培养上清中VEGF的含量 ,应用Western印迹检测肿瘤血管生成相关分子HIF 1α、P5 3和PTEN的表达水平 .成功地构建了负显性RhoA、Rac1和Cdc4 2的真核表达质粒 ,转染胃癌细胞AGS并经G4 18筛选出单克隆 .ELISA表明转染细胞培养上清中VEGF的含量可被明显抑制 ;Western印迹表明 ,负显性RhoGTPases在蛋白水平上可下调HIF 1α表达水平 ,上调P5 3的表达水平 .结果表明 ,Rho家族的 3个主要分子可能通过调节血管生成相关分子的表达来促进肿瘤血管生成 .     

转人肝刺激物质基因的肝癌细胞增殖状态研究

本文通过研究转染人肝刺激物质（hepatic stimulator substance,HSS）的肝癌细胞增殖状态,进一步探讨了该基因的生物功能。将人HSS基因导入BEL－7402肝癌细胞,用Northern和Southern杂交法证实该基因在靶细胞中有稳定表达。并通过测定细胞生长曲线、细胞S期比例和细胞MAPK活性,观察到转HSS基因BEL－7402细胞增殖发生了改变。实验结果提示,HSS表达的肝癌细胞DNA合成增加、增殖速度加快,可能与MAPK激活有关,HSS基因表达可促进细胞增殖。     

MicroRNA-21靶向调控β-catenin促进骨肉瘤细胞U2OS的增殖与侵袭

目的:研究微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)对骨肉瘤细胞U2OS增殖与侵袭的影响及其可能机制。方法:采用Real-time PCR (RT-PCR)检测miR-21在骨肉瘤和临近正常骨组织中的表达差异。通过脂质体转染法将miR-21模拟物(microRNA-21mimics,即mimics组)及microRNA无关序列(microRNA-NC,即NC组)转染入骨肉瘤细胞U2OS,real-time PCR(RT-PCR)检测miR-21和β-catenin m RNA在U2OS细胞中的表达,Western blot检测β-catenin蛋白在U2OS细胞中的表达,并通过双荧光素酶报告基因验证miR-21与β-catenin基因3'-非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)的特异性结合作用。MTT法检测U2OS细胞体外增殖能力;Transwell侵袭模型探查U2OS细胞侵袭潜能。结果:骨肉瘤组织中miR-21水平显著高于正常骨组织(P0.05)。过表达miR-21能够增强细胞增殖与侵袭,上调U2OS细胞β-catenin m RNA和蛋白的表达。双荧光素酶报告基因结果表明miR-21可与β-catenin基因3'-UTR结合,从而对β-catenin的表达起调控作用。结论:miR-21可能通过调节β-catenin的表达促进骨肉瘤细胞U2OS的增殖与侵袭。     

乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白（HBXIP）对细胞周期的影响

与乙肝病毒X蛋白（HBX）的C端结合,它具有抑制HBX活性的作用. 为进一步阐明HBXIP对细胞增殖的作用及其分子机制,构建了HBXIP的真核表达载体,并将其稳定转染至正常人肝细胞系L-O2细胞中,建立了稳定表达HBXIP蛋白的肝细胞系,命名为L-O2-hbxip. 然后,应用MTT、BrdU标记实验和流式细胞术等方法,发现HBXIP过表达后,L-O2细胞的生长速度明显加快,可促进细胞由G₁期进入到S期,表明HBXIP具有促进L-O2-hbxip细胞增殖的作用.应用免疫印迹对有关细胞周期相关蛋白进行了检测. 结果显示,HBXIP过表达时可上调细胞周期蛋白D₁、细胞周期蛋白E的表达,并下调p21和p27的表达,从而调节细胞周期,产生对细胞增殖的影响.     

CYB5D2对乳腺癌皮下移植瘤模型大鼠肿瘤生长的影响

[目的]研究CYB5D2对乳腺癌皮下移植瘤模型大鼠肿瘤生长的影响。[方法]通过乳腺癌MCF-7细胞系建立乳腺癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。将含有CYB5D2表达的质粒稳定转染MCF-7细胞,多点注射,将稳定转染的细胞注入裸鼠皮下,作为观察组,同时设置shRNA-CYB5D2阴性质粒为阴性对照组,PBS为空白对照组。测量各组大鼠肿瘤体积及质量;裸鼠转移瘤模型建立成功后处死小鼠,qRT-CPR法检测肿瘤组织内CYB5D2 mRNA表达水平;Western Blot法检测各组裸鼠转移瘤组织内上皮细胞间质转化(EMT)标志表白表达情况,酶联免疫吸附法检测裸鼠转移瘤细胞上清液中MMP-2及MMP-9水平。[结果]观察组转移瘤平均体积及质量显著低于阴性组与空白组(P<0.05),阴性组与空白组裸鼠转移瘤体积及质量无明显差异(P>0.05)。提取试验小鼠肿瘤组织总RNA,qRT-CPR法检测提示观察组肿瘤组织内CYB5D2 mRNA表达量显著高于阴性组及空白对照组(P<0.05),而阴性组与空白组间差异无显著性差异(P>0.05);Western Blot法检测结果显示,观察组转移瘤组织内E-cadherin、β-catenin蛋白表达水平显著高于与阴性组及空白组(P<0.05),而N-cadherin及Snail蛋白表达显著低于与阴性组及空白组(P<0.05)。阴性组与空白组转移瘤组织内E-cadherin、β-catenin、N-cadherin及Snail蛋白表达无显著性差异(P>0.05);观察组裸鼠转移瘤细胞上清液中MMP-2及MMP-9水平显著低于与阴性组及空白组(P<0.05),而阴性组与对照组MMP-2及MMP-9水平无显著性差异(P>0.05)。[结论]上调CYB5D2基因可有效抑制乳腺癌皮下移植模型大鼠瘤体生长,推测上调CYB5D2基因可能通过下调N-cadherin、Snail、MMP2及MMP9,上调E-cadherin、β-catenin,逆转EMT,发挥抗肿瘤功效。     

FBXO31基因对宫颈癌细胞增殖的影响

为了探讨FBXO31在宫颈癌中的表达情况及其对宫颈癌细胞增殖的影响及其可能机制,本研究采用实时定量PCR法检测FBXO31在宫颈癌组织中的表达水平;MTT法检测Hela细胞增殖能力;流式细胞术检测Hela细胞周期分布;Western blotting检测Hela细胞FBXO31、β-catenin、CyclinD1和c-Myc蛋白的表达水平。研究结果表明,FBXO31在宫颈癌组织中表达明显下调(p0.05)。FBXO31过表达能够明显抑制宫颈癌Hela细胞增殖能力。与空载质粒组比较,过表达FBXO31组的G1期细胞数显著增加,S期细胞数明显降低(p0.05)。本研究还发现FBXO31过表达能明显下调β-catenin蛋白、cyclin D1和c-Myc蛋白水平(p0.05)。本研究结论表明,FBXO31基因在宫颈癌中低表达;过表达FBXO31基因可通过抑制Wnt/β-catenin通路从而抑制宫颈癌细胞增殖。     

VD通过VDR下调β-catenin磷酸化水平抑制胃癌细胞增殖

为探讨维生素D(vitamin D, VD)及维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)对胃癌细胞增殖的作用及分子机制,该研究首先通过免疫荧光实验观察胃癌细胞SGC-7901和MKN-45中VDR的表达水平,进一步利用shRNA干扰慢病毒转染两种胃癌细胞,嘌呤霉素筛选建立shVDR稳定株,应用CCK8及细胞集落形成实验,流式细胞学实验, Western blot实验检测VD/VDR在两种胃癌细胞恶性表型增殖及细胞周期中的作用;最后再次应用Western blot实验检测VD/VDR对胃癌细胞中β-catenin磷酸化表达水平的影响。结果表明两种胃癌细胞均表达VDR;在配体骨化三醇(1α,25(OH)_2D_3)存在的情况下,胃癌细胞的增殖和集落形成受到明显抑制,同时抑制β-catenin的磷酸化水平,但对细胞周期分布及细胞周期蛋白Cyclin D1无明显作用。下调VDR的表达水平后, VD对β-catenin磷酸化表达水平无明显影响。证实VDR通过下调β-catenin的磷酸化水平,发挥抑制胃癌细胞增殖的作用。     

shRNA靶向干扰COX-2抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤及其血管生成

目的:探讨重组干扰质粒pshRNA-COX-2对人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤血管生成的抑制作用。方法:重组干扰质粒pshRNA-COX-2转染Hep3B细胞并筛选后,RT-PCR和Western blot检测COX-2mRNA和蛋白表达,RT-PCR检测VEGFmRNA表达。将被成功转染的Hep3B细胞种植于裸鼠皮下,测量肿瘤大小,4周后处死裸鼠,免疫组织化学法检测肿瘤组织中COX-2蛋白表达和肿瘤微血管密度(MVD)。结果:与未转染细胞相比,干扰组COX-2mRNA和蛋白表达抑制率分别为65.3%和52.8%(P<0.05),干扰组VEGFmRNA表达抑制率为56.5%(P<0.05)。干扰组瘤体大小明显小于阴性组和空白组(P<0.01)。干扰组COX-2得分和MVD均明显低于阴性组和空白组(P<0.01)。结论:pshRNA-COX-2通过抑制COX-2表达明显抑制人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤血管生成。