表达H9亚型禽流感流毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RT－PCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒（AIV）分离株（A／Chicken/China/F/1998)的血凝素（HA）基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7．5的下游,得到重组转移载体1175HA,以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞（CEF）中,通过在含X－gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-HA,以间接免疫荧光法证实感染rFPV-HA的CEF表达了HA,rFPV-HA在免疫7日SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制（HI）抗体,14天后诱生的HI抗体能达到高峰,且诱生的HI抗体保护较高水平达55天,在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行了免疫效力试验表明,rPV-HV能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建及其遗传稳定性与免疫效力

以鹅源H5亚型禽流感病毒(AIV)基因组为模板,用RTPCR扩增血凝素（Hemagglutinin, HA）基因,克隆入鸡痘病毒表达载体pFG1175,转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞,通过蓝斑筛选和间接免疫荧光检测,获得表达HA基因的重组鸡痘病毒（Recombinant fowlpox virus, rFPVHA）。rFPVHA经鸡胚成纤维细胞连续传15代后,报告基因LacZ和HA基因可稳定表达。用103PFU和105PFU的rFPVHA免疫无特定病原体的(Specific pathogen free, SPF)鸡,免疫后22d 血凝抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)抗体监测阳性率分别为0%和20%,但均抵御了H5亚型毒株的致死性攻击,保护率为100%。结果表明,构建了表达HA基因的重组鸡痘病毒,该重组病毒具有良好遗传稳定性,免疫鸡可提供完全保护,显示出了一定的应用前景。     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

共表达H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒（流感）的基因工程疫苗,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素（HA）基因、鸡Ⅱ型干扰素（IFN－Ⅱ）全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子（PE／L）的基因片段,定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7．5的下游,得到HA和IFN－Ⅱ基因分别处于P7．5及PE／L转录调控下的重组转移载体1175HAIFN。以脂质体转染法将1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞（CEF）中。1175HAIFN与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-HA-IFN-Ⅱ。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀获得并纯化rFPV-HA-IFN-Ⅱ。以间接免疫[荧光法和细胞病变抑制试验证实,纯化的rFPV-HA-IFN-Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗HSV活性的鸡IFN－Ⅱ。动物试验表明,rFPV-HA-IFN-Ⅱ能显著抑制静脉攻毒后1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒（rFPV-HA)抑制日龄SPF雏鸡增重的副作用。     

利用Cre-loxP自动敲除H5亚型禽流感病毒血凝素重组鸡痘病毒中的报告基因

研究去除重组鸡痘病毒中的报告基因,构建一株只含目的基因的重组毒。将H5亚型AIV的HA基因作为靶基因,两侧含loxP序列的GFP表达盒插入鸡痘病毒重组臂基因构建了转移质粒载体,将其与脂质体混合转染CEF细胞,获得了表达H5和GFP的鸡痘病毒重组体。通过二次转染,利用Cre酶自动敲除重组病毒中的GFP基因,最终获得了只含H5血凝素基因表达盒的重组鸡痘病毒。免疫荧光和病毒滴度测定结果表明,经过连续传代后重组病毒仍然稳定复制并表达H5血凝素。用10⁵PFU和2×10⁵PFU rFPV H5免疫SPF鸡,28d后,免疫组鸡抗体平均滴度(HI)分别达到4log 2和4.5log 2,结果表明,H5HA基因重组病毒能刺激鸡群产生较高特异抗体。     

表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

将新城疫病毒(NDV)F48E8株融合蛋白基因导入鸡痘病毒(FPV)插入载体pFG1175-1的P7-5启动子下游,得到转移载体pFG1175-1重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)。经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒rFPV-NDF。间接免疫荧光试验表明,rFPV-NDF感染的CEF中表达了NDV的融合蛋白。用rFPV-NDF免疫的SPF试验鸡能产生对NDV强毒攻击的免疫力,保护率达96.3%。     

共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护性研究

用本实验室构建的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghorn蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照.免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的影响、免疫后的攻毒保护效力、免疫后的抑制排毒情况.免疫后不同时间分别测定特异性抗体和淋巴细胞刺激指数.试验结果表明,3株重组鸡痘病毒株均能诱导鸡体产生血凝抑制抗体(HI);共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA-IL18和rFPV H5HA-H7HA-IL18诱导商品蛋鸡的细胞免疫水平明显高于非共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA.重组鸡痘疫苗免疫SPF和商品蛋鸡后第21d进行攻毒实验,rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫攻毒保护率达10/10,rFPV-H5HA免疫攻毒保护率达9/10,与常规疫苗相当.免疫的商品蛋鸡于攻毒后7d采集泄殖腔棉试子样品,检测排毒情况.结果表明,rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组在攻毒后第7d无排毒,其抑制免疫鸡排毒效果优于常规疫苗和单独表达HA的rFPV-H5HA重组鸡痘病毒.rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组鸡,在14日龄时的体重明显高于rFPV-H5HA免疫组和常规疫苗对照免疫组,表明共表达的鸡IL-18能降低鸡痘病毒载体对雏鸡增重的影响.     

共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护性研究

用本实验室构建的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghorn蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照.免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的影响、免疫后的攻毒保护效力、免疫后的抑制排毒情况.免疫后不同时间分别测定特异性抗体和淋巴细胞刺激指数.试验结果表明,3株重组鸡痘病毒株均能诱导鸡体产生血凝抑制抗体（HI）;共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA-IL18和rFPV H5HA-H7HA-IL18诱导商品蛋鸡的细胞免疫水平明显高于非共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA.重组鸡痘疫苗免疫SPF和商品蛋鸡后第21d进行攻毒实验,rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫攻毒保护率达10/10,rFPV-H5HA免疫攻毒保护率达9/10,与常规疫苗相当.免疫的商品蛋鸡于攻毒后7d采集泄殖腔棉试子样品,检测排毒情况.结果表明,rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组在攻毒后第7d无排毒,其抑制免疫鸡排毒效果优于常规疫苗和单独表达HA的rFPV-H5HA重组鸡痘病毒.rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组鸡,在14日龄时的体重明显高于rFPV-H5HA免疫组和常规疫苗对照免疫组,表明共表达的鸡IL-18能降低鸡痘病毒载体对雏鸡增重的影响.     

共表达H5亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效地抵抗高致病性H5亚型禽流感病毒的基因工程疫苗,将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体p11S中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p11SH5ANA。将p11SH5ANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5ANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-11SH5ANA。通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒。经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性。用105PFU的rFPV-11SH5NA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体。初步的动物试验表明,该重组病毒能使经肌肉注射攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%,显示出一定的应用前景。     

缺失ORF73或ORF214基因对重组鸡痘病毒免疫应答的影响

【目的】旨在研究鸡痘病毒ORF73和ORF214编码蛋白是否具有IL-18结合蛋白的功能,以及ORF73或ORF214基因缺失后对重组病毒诱导免疫应答的影响。【方法】以缺失ORF73或ORF214基因并表达H5亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-△73LRH5A、rFPVLP-△214LRH5A)作为研究对象,以未缺失ORF73或ORF214基因而表达H5亚型AIVHA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-12LSH5A)作为对照,检测重组病毒体外诱导SPF鸡脾细胞和外周血淋巴细胞产生IFN情况,同时检测重组病毒免疫SPF鸡后诱导的体液免疫、CD4+/CD8+比值、外周血淋巴细胞的增殖能力和H5亚型AIV强毒攻击后的免疫保护效力。【结果】rFPVLP-△73LRH5A和rFPVLP-△214LRH5A体外诱导脾细胞产生的IFN量显著高于rFPVLP-12LSH5A,而免疫10d后的CD4+/CD8+比值显著低于rFPVLP-12LSH5A;3种重组鸡痘病毒诱导外周血淋巴细胞增殖的能力没有明显差异;3种重组病毒在SPF鸡均产生针对H5亚型AIV的HI抗体,免疫14d后rFPVLP-△214LRH5A组诱生的HI抗体水平显著低于rFPVLP-12LSH5A组的抗体,但3组在免疫21d后HPAIV的致死性攻击时,均100%被保护。【结论】鸡痘病毒ORF73和ORF214编码蛋白具有IL-18结合蛋白抑制IFN产生的功能,虽然缺失株和亲本株重组鸡痘病毒在细胞和体液免疫应答存在一定差异,但在SPF鸡均能诱导产生良好的免疫保护。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

[目的]获得共表达H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组禽痘病毒.[方法]将含痘病毒启动子LP2EP2的HA基因和鸡IL-18基因插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSYHA/IL-18.用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA和IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-HA-IL-18).在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组禽痘病毒又进行了多次蚀斑克隆.[结果]以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因和鸡IL-18基因引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb带和1条0.6 kb左右的带.以间接免疫荧光试验、T细胞转化试验和SPF雏鸡免疫接种证实重组禽痘病毒能表达HA和鸡IL-18,并初步证明鸡IL-18增强HA免疫作用.[结论]重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA和鸡IL-18.     

共表达HIV-1中国流行株gp120与IL-18重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性观察

为筛选我国的HIV-1疫苗候选株,以鸡痘病毒282E4中国疫苗株为载体,构建了共表达中国流行株HIV-1外膜蛋白gp120和IL-18的重组鸡痘病毒,并将该重组鸡痘病毒免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果显示,HIV_1外膜蛋白gp120和IL-18不但可在重组鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞中表达,而且可在重组鸡痘病毒感染的哺乳动物细胞中表达。重组病毒具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性抗体和脾特异性CTL反应,且IL_18发挥了免疫佐剂的作用。本研究结果为制备安全、有效的HIV-1基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测

从ConA刺激的鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因编码区。将该编码区Cdna序列和调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子（PE/L）的基因片段定向克隆到鸡痘病毒转移载体p1175中,获得重组转移载体P1175il2,然后转染已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV）的鸡胚成纤维细胞（CEF）,质粒P1175il2与wt-FPV基因组DNA发生同源重组,产生了表达ChIL-2的重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得并纯化重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。应用XTT/PMS方法检测的Rfpv-IL2 （M.O.I 2.0）感染CEF 72小时后细胞上清中表达的重组ChIL-2生物活性,效价为3.6×105u/Ml,表明Rfpv-IL2能有效地表达ChIL-2。下一步将利用Rfpv-IL2在体内表达ChIL-2,研究ChIL-2的免疫增强作用及其作用机理。     

表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免？…

将将城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株融合蛋白基因导入鸡痘病毒（ＦＰＶ）插入载体ｐＥＧＦ１１７５－１的Ｐ７．５启动子下游,得到转移载体ｐＦＧ１１７５－１重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染ＦＰＶ２８２Ｅ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）。,经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒ｒＦＰＶ－ＮＤＦ。间接免疫荧光试验表明,ｒＦＰＶ－ＮＤＦ感染的ＣＥＦ中表达了ＮＤＶ的融合蛋白。用ｒＦＰＶ－ＮＤＦ免疫的ＳＦ     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。     

共表达禽流感病毒HA和NA基因重组禽痘病毒的遗传稳定性

将表达禽流感病毒H5HA及N1NA基因的重组禽痘病毒rFPV HA NA连续传代至 2 5代 ,取第 5、15及 2 5代重组病毒作为受检代次 ,进行外源基因的PCR扩增与测序 ,同时比较这 3个代次重组禽痘病毒的免疫效力。结果对各代次重组病毒DNA的模板进行PCR扩增 ,均能够获得HA和NA两个目的片段 ;经测序证明两个外源基因在细胞传代过程中没有发生氨基酸水平的改变。动物试验结果表明 ,该重组病毒的毒力在细胞传代过程中没有发生变化 ,接种试验鸡后在鸡体内能够检测到外源基因的存在 ,各免疫组在免疫 2周后的抗体效价平均为 6 5log2 ,完全抵抗了高致病力禽流感病毒的攻击。以上结果表明此重组病毒具有较好的遗传稳定性 ,经过 2 5代的传代后 ,所插入的外源基因及其表达产物的免疫原性未见变化 ,重组病毒的免疫效力相当稳定。     

柔嫩艾美耳球虫重组鸡痘病毒的构建与免疫保护研究

以鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了杂交株F2的Rhomboid蛋白家族相关基因,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建出克隆质粒pMD-Rhomboid.以KpnⅠ、PstⅠ双酶切重组质粒pMD-Rhomboid和鸡痘病毒载体质粒pUTA2,并将纯化的Rhomboid基因亚克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游,构建出真核表达重组质粒pUTA-Rhomboid.采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR和蛋白质印迹等方法检测,筛选出一株球虫鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid.进一步经CEF扩增病毒后,免疫雏鸡,监测免疫指标.结果表明:重组病毒接种鸡外周血中的CD4 、CD8 含量显著高于非免疫对照组(P<0.05);与对照组相比,重组病毒对鸡的增重效果差异显著(P<0.05),对E.tenella的攻击具有一定的保护作用,显示出较好的应用前景.