草地贪夜蛾热激蛋白基因SfHsp90的克隆及在高低温和UV-A胁迫下的表达分析

【目的】本研究旨在探索草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda响应高低温和UV-A胁迫的分子机制。【方法】通过RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾热激蛋白基因Hsp90,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-qPCR技术检测草地贪夜蛾Hsp90基因在不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(去除触角和复眼的头、胸、腹、触角、复眼、足、翅、中肠、精巢和卵巢)及在不同时长(0, 30, 60, 90, 120和150 min)高温(36℃)、低温(4℃)和UV-A胁迫下成虫中的相对表达量。【结果】克隆获得草地贪夜蛾Hsp90基因,命名为SfHsp90(GenBank登录号:MN832694),该基因开放阅读框(ORF)长2 154 bp,编码717个氨基酸,编码蛋白质相对分子量为82.52 kD,等电点(pI)为5.01,C末端序列含保守基序EEVD,说明该蛋白为胞质型热激蛋白。系统进化分析结果表明,昆虫Hsp90高度保守。发育表达模式显示SfHsp90在草地贪夜蛾1龄幼虫中表达量最高;组织表达模式显示,SfHsp90在草地贪夜蛾雌雄成虫的触角、复眼和去除触角和复眼的头中的表达量显著高于在其他组织中的。高低温胁迫对草地贪夜蛾SfHsp90表达具有明显的诱导作用,36℃胁迫下,SfHsp90表达量显著高于对照,且随着处理时间的延长,在雄成虫中表达量先上升后下降,在60 min时达到最高值,在雌成虫中表达量随处理时间延长逐渐升高;4℃胁迫下,在雄成虫中表达量随着处理时间的延长先上升后下降,在30 min时表达量达到峰值,在雌成虫中表达量随着处理时间延长逐渐上升;随着UV-A照射时间的延长,在雌雄成虫中表达量先上升后下降,90 min时在雄成虫中表达量达到最高值,60 min时在雌成虫中表达量达到最高值。【结论】草地贪夜蛾SfHsp90基因在高低温和UV-A胁迫下的差异表达说明该基因在草地贪夜蛾响应环境胁迫的分子机制中发挥重要作用。     

草地贪夜蛾V-ATPase亚基A、B、C和D基因的克隆与分析

【目的】克隆获得草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda V-ATP酶（Vacuolar-type proton,ATPase）V1结构域A、B、C和D亚基的cDNA序列,分析其在草地贪夜蛾不同生长阶段的表达情况,为筛选新型农药的靶点奠定基础。【方法】利用PCR技术获得草地贪夜蛾V-ATP酶V1结构域A、B、C和D亚基基因的ORF区域,采用qRT-PCR技术检测各基因在草地贪夜蛾不同发育时期的表达水平。【结果】A、B、C和D亚基基因均在不同鳞翅目昆虫中高度保守。A-D亚基在草地贪夜蛾各生长阶段均有表达,在幼虫阶段和成虫阶段的表达量均较高,表明V-ATP酶可能影响幼虫生长发育和成虫交配繁殖。卵期和蛹期表达量低,这与卵期和蛹期昆虫各项生命活动低有关。各亚基在各发育时期的表达量存在差异,说明V-ATP酶A、B、C和D发挥不同的功能。【结论】从草地贪夜蛾中克隆了V-ATP酶V1结构域A、B、C和D亚基4个基因在草地贪夜蛾不同发育阶段表达量具有差异,推测其对草地贪夜蛾的生长、发育和繁殖具有重要的调控作用。     

草地贪夜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α6和α7亚基基因克隆及其对乙基多杀菌素胁迫的响应

【目的】烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAchRs)作为昆虫中枢神经系统中重要的神经递质受体,是乙基多杀菌素的重要靶标。本研究旨在克隆草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda nAchR基因,并探析其对乙基多杀菌素胁迫的响应。【方法】基于前期草地贪夜蛾转录组数据,采用RT-PCR和RACE分别克隆草地贪夜蛾nAchR α6和α7亚基基因;乙基多杀菌素(0.400 mg/L)处理草地贪夜蛾3龄幼虫48 h后,采用RT-qPCR技术检测nAchR α6和α7亚基基因的表达量的变化。【结果】nAchR α6亚基基因(GenBank登录号: MT951400)开放阅读框长1 506 bp,编码502个氨基酸,并具有跨膜区与信号肽;nAchRs α7亚基基因(GenBank登录号: MW557608)开放阅读框长1 524 bp,编码508个氨基酸,并具有跨膜区与信号肽。根据氨基酸多序列比对分析,草地贪夜蛾nAchR亚基α6和α7具有烟碱性乙酰胆碱受体α家族典型特征。0.400 mg/L乙基多杀菌素胁迫48 h后,草地贪夜蛾3龄幼虫nAchR α6亚基基因表达量显著增加,而nAchR α7亚基基因表达量无显著性变化。【结论】乙基多杀菌素可能作用于草地贪夜蛾的nAchR α6亚基。本研究为深入研究草地贪夜蛾对乙基多杀菌素的靶标抗性机制奠定了初步基础。     

苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)表达及其生长发育的影响

【目的】几丁质酶和几丁质合成酶对昆虫的变态发育极其重要。本研究旨在阐明苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾Spodoptera litura几丁质酶和几丁质合成酶基因表达及其生长发育的影响。【方法】利用RT-qPCR检测斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)在斜纹夜蛾不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和4-6龄幼虫不同组织(体壁、中肠、脂肪体、血细胞、头部和马氏管)中的表达水平以及注射苦瓜素Ⅰ溶液(4 μg/头) 24, 48和72 h时斜纹夜蛾SlCht和SlCHS-A在6龄幼虫各组织中的表达水平。分析在斜纹夜蛾4龄幼虫中注射不同浓度(31.25, 62.5, 125, 250和500 ng/头)的苦瓜素Ⅰ溶液对幼虫和蛹历期、幼虫增重、蛹重、蛹长度、化蛹率、羽化率和存活率的影响,并利用体视显微镜观察斜纹夜蛾幼虫的表型变化。【结果】SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾中的表达具有发育阶段特异性。SlCht和SlCHS-A在卵期表达量最高,幼虫期和预蛹期的表达量较低;在各幼虫期又表现为6龄幼虫期表达量最高,在其他龄期的表达量低。SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾6龄幼虫中也显示出组织特异性表达,在血细胞和体壁中高表达,在头部、中肠和脂肪体中低表达。在斜纹夜蛾6龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ能诱导SlCht和SlCHS-A在其各组织中表达量降低;在4龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ后,斜纹夜蛾的生长发育受到抑制,幼虫增重延缓,发育历期延长,化蛹率下降甚至化蛹失败,幼虫及蛹出现较高的畸形率。【结论】苦瓜素Ⅰ可通过诱导SlCht和SlCHS-A表达量的降低来实现对斜纹夜蛾生长发育的抑制作用。本研究为进一步阐明苦瓜素对斜纹夜蛾生长发育的抑制机制提供了新的理论基础,并为进一步应用苦瓜素Ⅰ进行防控奠定了基础。     

白背飞虱海藻糖合成酶基因的表达特性及其在糖代谢调控中的作用

【目的】昆虫中海藻糖主要通过海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)在脂肪体中合成,当昆虫受极端环境胁迫时TPS能够诱导海藻糖累积从而起到保护作用。本研究旨在分析白背飞虱Sogatella furcifera两个TPS基因的发育和组织表达模式及其对糖类物质代谢调控功能,探究TPS基因在白背飞虱生长发育中的具体作用。【方法】基于实验室前期获得的两个海藻糖合成酶基因SfTPS1和SfTPS2片段序列,在本实验中也进行了基因克隆和测序筛选,比对两者确定了白背飞虱两个TPS基因序列。并通过MEGA 7.0软件构建基于氨基酸序列的白背飞虱与其他昆虫TPS的系统发育树。利用qRT-PCR技术检测这两个基因在白背飞虱不同发育阶段(4龄第1天若虫至3日龄成虫)和成虫不同组织(头、足、翅、中肠、脂肪体、表皮和马氏管)中的表达情况。合成这两个基因的dsRNA,并注射到白背飞虱5龄第1天若虫中进行RNAi。在RNAi 48和72 h后检测白背飞虱海藻糖酶基因TRE1-1,TRE1-2和TRE2的表达变化,海藻糖、葡萄糖和总糖原含量以及海藻糖酶活性。【结果】克隆获得白背飞虱SfTPS1和SfTPS2,ORF分别为2 424和2 115 bp,编码氨基酸数目分别为807个和704个,预测蛋白质分子量分别为90.37和80.56 kD,等电点分别为6.08和6.10。而且白背飞虱2个TPS氨基酸序列与褐飞虱Nilaparvata lugens TPS1和TPS2的一致性最高。发育阶段表达模式表明,白背飞虱TPS基因SfTPS1和SfTPS2在4龄若虫到成虫阶段都有表达;组织表达模式表明,SfTPS1和SfTPS2在成虫马氏管、中肠和表皮中的表达较为显著。当SfTPS1被RNAi后,TRE1-1和TRE2的表达水平与对照组(dsGFP注射组)相比分别为略有上升和显著升高,TRE1-2的相对表达水平在SfTPS1被RNAi 48 h后显著上升而在72 h后显著下降;可溶性海藻糖酶活性无显著变化,膜结合型海藻糖酶活性显著增加;白背飞虱5龄若虫体内海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升。TRE1-2和TRE2基因的表达水平在SfTPS2被RNAi 48 h后显著升高,而在72 h后两基因的表达水平却显著下降;TRE1-1基因的表达水平在注射dsSfTPS2 48和72 h后均显著上升。可溶性海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 48 h后显著下降,72 h后显著上升;膜结合型海藻糖酶活性在SfTPS2被RNAi 72 h后显著增加。白背飞虱5龄若虫体内葡萄糖含量在SfTPS2基因RNAi 48 h后显著减少,但在72 h后海藻糖、葡萄糖和总糖原含量显著上升。【结论】通过调节白背飞虱体内TPS基因的表达影响TRE1-1,TRE1-2及TRE2基因的表达水平,进而调控体内海藻糖的含量,该结果为后期采用TPS为靶标基因用于害虫防治提供理论依据。     

镉胁迫对草地贪夜蛾生长发育及松毛虫赤眼蜂寄生的影响

【目的】为探究镉胁迫对植食性昆虫草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的影响以及是否通过“bottom-up”级联效应影响赤眼蜂Trichogramma的寄生能力。【方法】在室内调查了孵化24 h内的草地贪夜蛾幼虫取食添加了不同浓度(0,0.2和51.2 mg/kg)Cd²⁺的饲料后,草地贪夜蛾生长发育和繁殖力(单雌产卵量)和子一代卵内镉含量,并调查了松毛虫赤眼蜂T.dendrolimi成蜂对低浓度(0.2 mg/kg) Cd²⁺胁迫的草地贪夜蛾卵的寄生能力及偏好性。【结果】与对照(正常人工饲料)相比,人工饲料中0.2和51.2 mg/kg Cd²⁺均导致草地贪夜蛾幼虫历期显著延长、雌蛹重显著降低;高浓度(51.2 mg/kg)Cd²⁺处理下草地贪夜蛾的化蛹率、成虫羽化率、成虫寿命和单雌产卵量均显著降低;而低浓度(0.2 mg/kg)Cd²⁺处理下草地贪夜蛾的单雌产卵量略高于对照,且低浓度Cd²⁺胁迫下草地贪夜蛾卵的镉含量为1.03 mg/k...     

ATP合酶亚基d参与海藻糖代谢调控棉铃虫幼虫变态的分子机理

【目的】本研究旨在解析ATP合酶亚基d(ATP synthase subunit d, ATPs-d)参与海藻糖代谢调控棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫发育和变态中的功能及分子机理。【方法】PCR扩增棉铃虫HaATPs-d的开放阅读框，并利用生物信息学方法对其序列及系统发育进行分析；利用qRT-PCR检测HaATPs-d在5龄蜕皮期幼虫和6龄幼虫表皮、中肠和脂肪体中及对20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)(0.1 mg/mL)响应的6龄幼虫脂肪体和表皮中的表达量；利用荧光拍照分析HaATPs-d在草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞系Sf9细胞中的亚细胞定位；采用酵母双杂交分析与HaATPs-d互作的蛋白；对棉铃虫6龄幼虫注射dsHaATPs-d,分析RNAi降低HaATPs-d的表达量对幼虫发育及变态和中肠中可溶性海藻糖酶活性和海藻糖含量的影响。【结果】棉铃虫HaATPs-d(GenBank登录号：LOC110375576)的开放阅读框长525 bp,编码174个氨基酸并具有较高的保守性，与草地贪夜蛾和斜纹夜蛾S...     

亚洲玉米螟卵黄原蛋白受体基因的克隆及在UV-A胁迫下的表达分析

【目的】本文旨在克隆亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis卵黄原蛋白受体(VgR)基因,分析其表达模式,探索UV-A胁迫对亚洲玉米螟VgR基因表达的影响。【方法】利用RT-PCR与RACE技术克隆亚洲玉米螟VgR基因的全长序列;运用生物信息学方法分析该基因特征;采用RT-qPCR技术检测不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹、成虫)、雌成虫不同组织(头、足、表皮、卵巢、中肠、脂肪体)、雌成虫不同时长(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4和4.5 h)UV-A胁迫下该基因的相对表达量。【结果】克隆获得了亚洲玉米螟VgR基因,命名为OfVgR(GenBank登录号:MN058042),其全长6 289 bp,开放阅读框(ORF)5 490 bp,编码1 829个氨基酸,预测蛋白分子量为205.27 ku,N端前31个氨基酸为信号肽。序列分析显示,OfVgR具有2个配体结合域(LBD)、2个表皮生长因子前体同源域(EGFP)、跨膜域(TMD)和胞质尾域。系统发育树分析表明,OfVgR与鳞翅目昆虫VgR聚为一支,亲缘关系较近。RT-qPCR检测结果表明,OfVgR在亚洲玉米螟各发育阶段均有表达,其中在卵和雌成虫中高表达,并在雌成虫羽化24 h时表达量达到最高;雌成虫不同组织中,OfVgR在卵巢中表达量最高;OfVgR表达量随着UV-A照射时间的延长呈先下降后上升再下降的趋势,在3.0 h达到最高值。【结论】亚洲玉米螟OfVgR在不同发育阶段,雌成虫不同组织和UV-A胁迫不同时间的雌成虫中差异表达,对探索UV-A胁迫对亚洲玉米螟生殖的分子机制影响奠定基础。     

亚洲玉米螟卵黄原蛋白基因的克隆、表达谱及对UV-A胁迫的响应

【目的】本研究克隆亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis卵黄原蛋白(vitellogenin, Vg)基因,分析其表达模式,旨在探究UV-A胁迫对亚洲玉米螟Vg基因表达及生殖力的影响。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆亚洲玉米螟Vg基因的全长,并用生物信息学方法分析其特征;利用RT-qPCR检测亚洲玉米螟不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、雌成虫不同组织(头、足、表皮、卵巢、中肠和脂肪体)中和雌成虫在UV-A胁迫不同时间(0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5和4 h)下该基因的相对表达量。测定UV-A照射不同时长(0, 1, 2, 3和4 h/d)后亚洲玉米螟成虫的生殖及F_1代发育情况。【结果】克隆获得亚洲玉米螟Vg基因的序列,命名为OfVg(GenBank登录号:MK782978)。该基因全长5 760 bp,开放阅读框(ORF)长5 331 bp,编码1 776个氨基酸,蛋白相对分子量为202.10 kD,等电点为9.06。OfVg包含Vg-N, DUF 1943D和VWD 3个功能结构域,无跨膜区结构。系统发育分析表明,OfVg与鳞翅目其他昆虫的Vg的亲缘关系最近。发育表达谱表明,OfVg基因在雌成虫中表达量显著高于其他龄期的表达量,且在雌虫羽化24 h时OfVg表达量最高;组织表达谱表明,OfVg基因在雌成虫脂肪体中特异表达。UV-A照射能诱导雌成虫OfVg的表达,随着照射时间的延长,其表达量先下降再快速上升,在照射3.5 h时其表达量最高,然后骤降;UV-A处理1, 2和3 h/d雌成虫的产卵量显著增加,且F_1代幼虫发育历期显著延长。【结论】OfVg基因在亚洲玉米螟不同发育阶段、雌成虫不同组织中和UV-A照射不同时间的雌成虫中差异表达。本研究为深入研究UV-A胁迫对亚洲玉米螟发育和繁殖的影响奠定了基础。     

草地贪夜蛾雄性成虫和5龄幼虫的转录组比较分析

【目的】草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是一种新近入侵我国的重要害虫。本研究旨在对草地贪夜蛾雄性成虫和5龄幼虫两个不同发育阶段的转录组进行比较分析。【方法】利用高通量测序技术对草地贪夜蛾雄性成虫和5龄幼虫进行转录组测序和数据组装,并对转录组数据进行功能注释和比较分析。【结果】经de novo组装共获得209 002条转录本,平均长度为687.55 bp,N50为982 bp。共有46 198条(57.43%) unigene在至少一个数据库中获得功能注释,其中1 713条(2.13%) unigene在所有数据库中均能获得注释。在GO数据库中获得205 269条unigene的注释,主要包括68个功能分类;在KEGG数据库中共有3 408条unigene得到注释,涉及277个代谢通路。共鉴定到424个嗅觉相关的基因,并且在雄性成虫和5龄幼虫之间的表达存在差异。通过比较转录组分析,在雄性成虫中鉴定到9 162个上调和6 399个下调差异表达基因(DEGs);功能富集分析发现在上调DEGs中涉及信息素以及信号转导的代谢通路显著富集,而下调DEGs中涉及解毒相关的通路显著富集。【结论】这些转录组数据为探究草地贪夜蛾的生长发育、嗅觉相关功能基因以及候选分子靶标提供资源信息。     

德国小蠊两个海藻糖合成酶基因的克隆、组织分布及温度诱导表达分析

【目的】海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）是参与昆虫血糖-海藻糖合成的关键酶。本研究旨在克隆德国小蠊 Blattella germanica TPS基因,研究TPS基因在德国小蠊不同组织中的表达模式及在不同温度处理下的表达情况。【方法】通过RACE技术克隆德国小蠊TPS基因全长序列,利用荧光定量PCR的方法检测TPS基因在德国小蠊5龄幼虫不同组织中的表达模式及在高温(40℃和46℃处理30 min)及低温(0℃和10℃处理1 h)逆境下的表达量变化。【结果】从德国小蠊中克隆获得2个TPS基因,分别命名为 BgTPS1 (GenBank登录号：KR050213) 和 BgTPS2 (GenBank登录号：KR050214)。其中,BgTPS1基因cDNA序列全长2 987 bp,开放阅读框 (ORF) 2 502 bp,编码833个氨基酸;BgTPS2基因cDNA序列全长3 212 bp,开放阅读框2 469 bp,编码822个氨基酸。BgTPS1和BgTPS2基因都主要在5龄幼虫脂肪体中表达,且BgTPS2基因的表达量为BgTPS1基因表达量的3.9倍。在两种不同极端温度诱导下,BgTPS1和BgTPS2基因mRNA均上调表达。其中,BgTPS2 的表达量始终显著高于 BgTPS1。在0℃时,BgTPS1和BgTPS2的表达量最高。【结论】德国小蠊5龄幼虫中存在2个TPS基因。两个TPS基因均在脂肪体中高表达,且BgTPS2基因的表达量显著高于BgTPS1基因;低温和高温诱导下均能促进两个基因的表达量上升。该结果为进一步明确昆虫海藻糖的合成途径及其在昆虫对温度逆境的反应中的作用研究奠定了基础。     

甜菜夜蛾肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA的克隆及功能鉴定

【目的】本研究旨在阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫体内肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)在响应苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)感染过程中的功能。【方法】利用PCR方法扩增甜菜夜蛾幼虫肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA全长cDNA;采用qRT-PCR分析SePGRP-SA在甜菜夜蛾不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、预蛹和蛹)及4龄幼虫不同组织(中肠、马氏管、围食膜、脂肪体、血淋巴和表皮)中的表达。通过RNAi技术沉默SePGRP-SA基因72 h后,qRT-PCR检测SePGRP-SA沉默效率及甜菜夜蛾4龄幼虫中肠抗菌肽相关基因(Ceropin, Attacin和Defensin)和细菌载量的变化。RNAi沉默SePGRP-SA 24 h后,以苏云金芽胞杆菌菌株Bt-GS57饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫0, 24, 48, 72, 96和120 h,计算幼虫校正死亡率;饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫Bt-GS57后0, 24, 48和72 h,利用qRT-PCR检测中肠SePGRP-SA, Ceropin, Attacin和Defensin的相对表达量。【结果】克隆获得甜菜夜蛾SePGRP-SA全长DNA(GenBank登录号：MW265930),开放阅读框长576 bp,编码191个氨基酸,其编码蛋白的预测分子量为21.59 kD。序列分析结果表明,SePGRP-SA具有典型的PGRP和Ami2保守结构域,信号肽为19个氨基酸,为分泌型蛋白;系统进化分析发现,SePGRP-SA与斜纹夜蛾Spodoptera litura的SlPGRP亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达91.1%。发育表达谱结果表明SePGRP-SA在甜菜夜蛾4和5龄幼虫、预蛹和蛹中高表达;组织表达谱结果表明,SePGRP-SA在4龄幼虫各组织中均表达,其中以血淋巴中表达量最高。与注射dsEGFP(对照)相比,注射dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫在72 h时中肠SePGRP-SA基因表达量下调了95.26%,Cecropin, Attacin和Defensin表达量显著下调,中肠细菌载量显著升高。注射dsEGFP和dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫饲喂Bt-GS57,72 h时幼虫校正死亡率分别为50.00%和73.33%,表明幼虫对Bt-GS57的敏感性明显增加。甜菜夜蛾4龄幼虫取食Bt-GS57后,中肠SePGRP-SA, Cecropin, Attacin和Defensin表达量在48 h均显著增加,72 h时降低。【结论】Bt侵染能够引起甜菜夜蛾SePGRP SA基因激活抗菌肽相关基因Cecropin, Attacin和Defensin的表达。     

小分子热激蛋白基因HaHSP19.8在棉铃虫抗逆反应中的作用

【目的】小分子热激蛋白(small heat shock protein, sHSP)在昆虫抵御外界环境压力中至关重要。本研究旨在探究小分子热激蛋白sHSP19.8基因在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育、抵御高温胁迫和对Cry1Ac杀虫蛋白抗性机制中的作用,为更深入探析该基因作用机理及棉铃虫的防治奠定基础。【方法】通过PCR结合RACE克隆棉铃虫sHSP19.8基因序列,利用生物信息学软件对该基因序列进行分析;通过qRT-PCR测定Cry1Ac敏感棉铃虫5龄幼虫在40℃高温下处理1 h和2 h及饲喂含30 μg/mL Cry1Ac的人工饲料1 h和2 h后该基因的表达量,并测定抗感Cry1Ac棉铃虫不同发育阶段(1-5龄幼虫、蛹及成虫)和5龄幼虫不同组织(前肠、中肠、后肠、马氏管及表皮)中该基因的表达模式。【结果】获得了棉铃虫sHSP19.8基因的全长cDNA序列,命名为HaHSP19.8(GenBank登录号: XP_021195228.1),长608 bp,开放阅读框长528 bp,编码175个氨基酸残基,具有小分子热激蛋白的典型α-晶体结构域(α-crystallin domain, ACD)。该基因受40℃高温和30 μg/mL Cry1Ac杀虫蛋白诱导时在Cry1Ac敏感棉铃虫5龄幼虫中均过量表达;在Cry1Ac敏感棉铃虫整个发育阶段和5龄幼虫各组织中均表达,其中在成虫和5龄幼虫以及5龄幼虫表皮、马氏管和中肠内表达量较高;但是该基因在Cry1Ac抗性品系各个发育阶段和5龄幼虫各组织中表达量相比敏感品系都显著较低。【结论】结果说明HaHSP19.8参与棉铃虫生长发育和生理生化的过程,帮助昆虫抵御外界环境压力,并可能参与到棉铃虫对Cry1Ac的抗性机制中。     

荔枝蒂蛀虫幼虫龄数及各发育阶段在不同温度下的发育历期

【目的】荔枝蒂蛀虫 Conopomorpha sinensis Bradley是荔枝龙眼上的主要害虫,以幼虫蛀果为害。本研究旨在明确荔枝蒂蛀虫幼虫龄数及不同温度下各虫态和各龄幼虫的发育历期,为该虫发生规律、预测预报和防控技术研究提供基础生物学数据。【方法】定期收集处于不同发育时期的荔枝蒂蛀虫幼虫,测量幼虫头壳宽度,对其进行频次分析,Crosby指数验证和曲线回归分析,以确定幼虫龄数。通过室内群体饲养的方法,测定了17~38℃区间8个温度梯度下荔枝蒂蛀虫各虫态和各龄幼虫的发育历期,并采用线性日度模型对其发育速率与温度的关系进行回归分析。【结果】根据荔枝蒂蛀虫幼虫头壳宽度频次分布图,其头壳宽度的频次分布可明显分为5个区域,说明其幼虫分5个龄期,符合Dyar定律。1-5龄幼虫的头壳宽度分别为：0.092~0.120, 0.140~0.206, 0.217~0.319, 0.356~0.523和0.582~0.728 mm。温度对荔枝蒂蛀虫卵、各龄幼虫和蛹的发育历期有明显影响,其发育历期均随温度的升高而缩短,其发育速率均与温度呈显著正相关,并符合线性回归模型。在20~32℃,荔枝蒂蛀虫可完成世代发育;在17℃时,该虫只能发育至3龄幼虫;在35℃时,蛹多不能羽化;在38℃时,卵多不能孵化。在20~32℃,其世代历期为41.16~19.34 d,蛹期为12.74~5.38 d,而产卵前期为4.75~4.22 d,温度对产卵前期无明显影响。在20~35℃,荔枝蒂蛀虫幼虫可正常发育,其1龄幼虫龄期为4.50~1.17 d,2龄幼虫期为2.09~1.40 d,3龄幼虫期为2.84~1.00 d,4龄幼虫期为3.41~1.18 d,5龄幼虫期为3.00~1.37 d,预蛹期为2.41~0.69 d。在17~35℃,荔枝蒂蛀虫卵可正常孵化,其卵期为7.73~2.09 d。【结论】荔枝蒂蛀虫幼虫分5个龄期,不同于前人所报道的4个龄期。在20~32℃温度范围内,卵、各龄幼虫和蛹的发育历期均随温度升高而缩短。本研究结果有助于荔枝蒂蛀虫预测预报方案的制定和实施。     

粘虫谷氨酰胺转胺酶(MsTGase)活力测定条件的正交优化及其在幼虫体内的分布

【目的】本研究旨在优化Grossowicz氧肟酸比色法测定粘虫Mythimna separata谷氨酰胺转胺酶(Ms TGase)活力的组合条件,以Ms TGase酶活力为依据分析其在不同龄期幼虫体内的分布规律。【方法】取4龄粘虫幼虫,通过组织匀浆和沉析纯化制备Ms TGase,采用Grossowicz比色法测定Ms TGase酶活力,并对Grossowicz比色法的多重实验因素进行正交优化,进一步结合差速离心法分析不同龄期幼虫体内和亚细胞组分(细胞核和细胞碎片,线粒体,微粒体以及胞质溶胶)中Ms TGase酶活力。【结果】结果表明,酶浓度、底物浓度、反应体系pH值、反应温度及钙离子浓度等实验因素都对Ms TGase酶活力测定结果产生显著影响,其影响大小顺序为:酶浓度>温度> p H>底物浓度>Ca2+浓度。Ms TGase酶比活力测定的最优化条件:酶浓度20 mg/m L、底物浓度0. 04 mol/L、反应体系pH值6. 5、测定温度37℃,不添加钙离子。在1-5龄幼虫中以4龄幼虫的Ms TGase酶活力最高,其比活力也显著高于其他龄期的,且在1-5龄幼虫胞质溶胶中Ms TGase酶活力分别占各亚细胞组分酶活力总和的39%,25%,48%,60%和61%。【结论】所获得的最优化条件适用于粘虫Ms TGase酶活力测定。Ms TGase在粘虫体内呈显著的龄期表达特征和亚细胞分布规律。     

黄玛草蛉幼虫对草地贪夜蛾卵和低龄幼虫的捕食能力

【目的】明确本地优势天敌黄玛草蛉Mallada basalis对入侵我国的重大农业害虫草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵及低龄幼虫的捕食能力和生防潜力。【方法】在实验室条件下采用功能反应模型评价了黄玛草蛉2和3龄幼虫对草地贪夜蛾卵及1和2龄幼虫的捕食能力。【结果】黄玛草蛉幼虫对草地贪夜蛾卵和低龄幼虫的捕食量均随猎物密度的升高而增加,最后趋于捕食饱和状态,而其捕食率随猎物密度的升高而逐步下降,对不同发育阶段的草地贪夜蛾均表现为Ⅱ型功能反应。黄玛草蛉2龄幼虫对草地贪夜蛾卵及1和2龄幼虫的瞬时攻击率a分别为0.150, 0.084和0.094,处理时间Th分别为0.282, 0.333和0.519 h,理论日最大捕食量T/Th分别为85106粒、72072头和46.242头;黄玛草蛉3龄幼虫对草地贪夜蛾卵及1和2龄幼虫的瞬时攻击率分别为2.018, 0.288和0.259,处理时间分别为0.102, 0.311和0.375 h,理论日最大捕食量分别为235294粒、77170头和64000头。【结论】黄玛草蛉2和3龄幼虫对草地贪夜蛾卵和低龄幼虫均具较强的捕食能力,其中黄玛草蛉3龄幼虫比2龄幼虫具有更强的捕食效率。     

斜纹夜蛾蜕皮激素合成通路相关CYP450基因的鉴定及表达分析

【目的】本研究旨在探讨蜕皮激素合成通路相关CYP450基因的表达规律,为害虫防治提供潜在的作用靶标。【方法】以家蚕Bombyx mori CYP450基因为查询序列,通过同源比对的方法从斜纹夜蛾Spodoptera litura基因组中鉴定蜕皮激素合成代谢通路中的CYP450基因,并构建其系统进化树;采用qPCR法检测鉴定的CYP450基因在斜纹夜蛾不同发育阶段(6龄幼虫、预蛹和蛹)、这3个发育阶段的不同组织(中肠、表皮和脂肪体)以及4龄幼虫取食不同寄主植物(辣椒Capsicum annuum、黄瓜Cucumis sativus、番薯Ipomoea batatas和花生Arachis hypogaea)叶片后5龄幼虫中肠中的表达量,计算4龄幼虫取食不同寄主植物叶片后发育至蛹的历期;应用PITA, miRanda, microTar和RNAhybrid 4种软件,预测调控鉴定的CYP450基因的微小RNA (miRNA)。【结果】鉴定到斜纹夜蛾蜕皮激素合成通路相关的6个直系同源CYP450基因CYP307A1, CYP306A1, CYP302A1, CYP315A1, CYP314A1和CYP18A1;系统进化树显示,斜纹夜蛾这6个CYP450基因分别归属于CYP2和线粒体CYP两个亚家族。CYP306A1, CYP314A1和CYP18A1分别在6龄幼虫、预蛹和蛹期具有最高的表达量,并且分别在6龄幼虫中肠、预蛹脂肪体和蛹表皮中表达量最高。相比取食人工饲料的对照组,4龄幼虫取食番薯和花生叶片后斜纹夜蛾4龄幼虫发育至蛹的历期显著延长, CYP306A1在5龄幼虫中肠中的表达量显著上调。在CYP307A1,CYP315A1, CYP314A1和CYP18A1上鉴定出了多种miRNA结合位点。【结论】蜕皮激素合成代谢通路中,CYP306A1,CYP314A1和CYP18A1可能分别在斜纹夜蛾幼虫、预蛹和蛹期起着关键的调控作用,同时也参与宿主植物次生代谢产物的解毒代谢,并且受到miRNA的严密调控。研究结果不仅有助于深入理解昆虫变态发育调控的复杂机制,还为将来的害虫防治提供了潜在的作用靶标,有利于斜纹夜蛾等害虫的可持续治理。     

草地贪夜蛾幼虫对常用杀虫剂相对敏感基线的建立

【目的】本研究旨在建立草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda对常用杀虫剂的相对敏感基线,为我国草地贪夜蛾的抗药性系统性监测提供依据。【方法】从玉米田采集草地贪夜蛾在室内不接触任何杀虫剂连续饲养5~7代,采用浸叶法和点滴法测定了草地贪夜蛾3龄幼虫以及采用饲料药膜法测定了草地贪夜蛾2龄幼虫对6大类共7种常用杀虫剂(甲维盐、乙基多杀菌素、虫螨腈、茚虫威、四氯虫酰胺、虱螨脲和氯虫苯甲酰胺)的敏感性,并据此建立了草地贪夜蛾幼虫对这7种杀虫剂的相对敏感基线。【结果】浸叶法测得上述7种药剂对草地贪夜蛾幼虫的LC₅₀值在0.054~12.131 mg/L之间;点滴法测得上述6种药剂(不含虱螨脲)对草地贪夜蛾幼虫的LD₅₀值在0.355~4.707 μg/g之间;饲料药膜法测得上述7种药剂对草地贪夜蛾幼虫的LC₅₀值在0.003~0.238 μg/cm²之间。【结论】采用3种生测方法建立了草地贪夜蛾幼虫对几种常用杀虫剂的相对敏感基线,为我国草地贪夜蛾的抗药性监测和化学防治提供了依据。