禾谷炭疽菌RGS蛋白生物信息学分析

【目的】明确禾谷炭疽菌中存在的典型RGS,及其信号肽、跨膜区、二级结构特征,明确该菌RGS与其他病菌之间的关系,最终为深入开展RGS定位、功能研究打下坚实的理论基础,也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。【方法】基于酿酒酵母中已经报道的4个典型RGS序列,利用BLASTp以及关键词对禾谷炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,以及通过SMART保守结构域分析。同时,通过对禾谷炭疽菌中典型RGS氨基酸序列进行细胞信号肽、跨膜区结构以及二级结构等生物信息学分析,此外,通过对禾谷炭疽菌中的典型RGS与其他物种中的同源序列进行遗传关系比较分析。【结果】明确禾谷炭疽菌存在6个典型的RGS,上述RGS在蛋白质二级结构中均含有较高比例的α螺旋结构,而在信号肽方面,除CgRGS6含有明显的信号肽序列外,其他RGS则没有;6个RGS中3个定位在细胞核中,其他则定位在质膜、内质网、线粒体上。【结论】禾谷炭疽菌中的RGS与C.higginsianum、C.gloeosporioides Cg-14/Nara gc5、C.orbiculare等炭疽菌属中的病菌具有较高的同源序列,以及较近的亲缘关系。     

希金斯炭疽菌RGS蛋白生物信息学分析

目的:由希金斯炭疽菌侵染菜心、萝卜等十字花科蔬菜引起的炭疽病,不仅降低了蔬菜的产量,还影响着蔬菜的品质。RGS作为植物病原菌G蛋白信号转导过程中的重要调节因子,在众多生理生化过程中发挥着重要作用。对希金斯炭疽菌中典型RGS进行明确以及生物信息学分析,为深入开展该菌RGS功能研究打下坚实的理论基础。方法:基于酿酒酵母中4个典型RGS序列,利用Blastp以及关键词对希金斯炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,以及通过SMART保守结构域分析,获得典型的RGS,并对上述RGS进行二级结构、疏水性、信号肽以及亚细胞定位等生物信息学分析。结果:希金斯炭疽菌中的RGS在蛋白质二级结构中均含有较高比例的α螺旋结构,均不含有典型的信号肽序列,均为亲水性蛋白;其中3个定位在细胞核中,其他2个则分别定位于高尔基体、线粒体上。结论:希金斯炭疽菌中有5个典型的RGS,在二级结构特征、亲水性方面一致,但其亚细胞定位位置不同。     

希金斯炭疽菌腺苷酸环化酶相关蛋白生物信息学分析

[目的]希金斯炭疽菌可引起菜心、萝卜等十字花科植物的炭疽病,给经济产生巨大损失。目前,炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂所产生的抗性问题引起了学者广泛关注,有待于开发新的作用靶标的化学药剂。腺苷酸环化酶(AC)在G蛋白信号传导途径上发挥着重要作用。[方法]基于酿酒酵母中Srv2序列,通过Blastp比对及关键词搜索,并利用SMART进行保守结构域分析,同时,通过对该菌中AC相关蛋白序列进行理化性质、信号肽、跨膜结构域等分析。[结果]明确该菌含有2个与Srv2同源的AC相关蛋白Cg Cap1、Cg Cap2,就理化性质、二级结构等特征方面而言,Cg Cap1、Cg Cap2与Srv2有着较大的差异。此外,通过对Srv2与Cg Cap1、Cg Cap2及其同源序列进行比对分析,发现Cg Cap1、Cg Cap2序列分别与其同源序列及Srv2的C端、N端具有较大的相似性,推测上述序列分别为希金斯炭疽菌AC的C端和N端。[结论]该研究为深入开展该菌AC的研究打下坚实的理论基础。     

全基因组预测禾谷炭疽菌的分泌蛋白

目的:禾谷炭疽菌侵染玉米、小麦等农作物引起的炭疽病,给农业生产造成了巨大经济损失。分泌蛋白在植物病原菌对植物侵染、定殖、扩展等致病过程中,发挥着重要作用。对禾谷炭疽菌分泌蛋白进行预测,并对其特征进行明确。方法:利用SignalP、ProtComp、TMHMM、big-PI Fungal Predictor和TargetP预测程序对禾谷炭疽菌中120 006条蛋白质序列进行分泌蛋白找寻,同时,对上述分泌蛋白的氨基酸分布、信号肽长度大小、信号肽切割位点以及理化性质等进行分析。结果:禾谷炭疽菌含有分泌蛋白为630个,其氨基酸长度多集中于100~600 aa之间;信号肽长度以17~20个aa的序列最为集中;信号肽切割位点属于A-X-A类型;分泌蛋白在分子量、等电点、稳定系数方面均存在差异,但大多数分泌蛋白属于亲水性蛋白。此外,上述分泌蛋白中,具有预测功能的蛋白为330个,其功能较多的集中于酶类,包括α-半乳糖苷酶、β-木聚糖酶、β-木糖苷酶等。结论:通过上述生物信息学分析方法有效地实现了禾谷炭疽菌分泌蛋白的预测,分泌蛋白的信号肽切割位点类型与已经报道的致病疫霉、粗糙脉孢霉等分泌蛋白信号肽切割位点一致,分泌蛋白功能涉及较多的酶类,也与其他已经报道的病菌分泌蛋白功能相类似。     

禾谷炭疽菌磷脂酰肌醇转移蛋白生物信息学分析

目的:禾谷炭疽菌侵染玉米、小麦等农作物引起的炭疽病,给各国农业生产造成了巨大经济损失。植物病原菌在对植物侵染、定殖、扩展等致病过程中,细胞信号转导起着重要的作用。磷脂酰肌醇转移蛋白(PITP)参与众多生理生化过程,并在细胞信号转导过程中发挥重要作用。本研究为深入开展禾谷炭疽菌PITP的功能研究打下坚实的理论基础,同时,也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。方法:基于酿酒酵母中已经报道的5个典型PITP序列,对炭疽菌属蛋白质数据库进行Blastp比对以及关键词搜索,并通过SMART保守结构域分析。结果:明确禾谷炭疽菌存在3个典型的PITP,同时,明确上述蛋白疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构、亚细胞定位以及二级结构等情况。结论:与其他物种中9个同源序列进行遗传关系比较分析,该菌与希金斯炭疽菌亲缘关系较近。     

禾谷镰刀菌cAMP受体类GPCR生物信息学分析

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的主要致病菌。G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRs)是一类重要的细胞表面受体,其介导的cAMP信号通路可能参与了禾谷镰刀菌的致病和毒素合成,因此分析cAMP受体类型的GPCRs蛋白的结构及其理化性质对了解GPCRs的功能及其与赤霉病致病的关系具有重要意义。本研究运用生物信息学方法,对禾谷镰刀菌全基因组序列中cAMP类GPCR基因进行了生物信息学分析。发现禾谷镰刀菌中存在5个典型的cAMP受体类型GPCRs:FgcAR1、FgcAR2、FgcAR3、FgcAR4和FgcAR5,均含有7个跨膜结构域,并定位于细胞膜上。除FgcAR1外,其余为疏水性蛋白。蛋白质二级结构分析表明,均含有大量α螺旋,比例在60%左右,FgcAR4和FgcAR5没有β转角,FgcAR1、FgcAR2和FgcAR3也只有较少比例的β转角。这些GPCRs中含有较多的Ser和Thr磷酸化位点。遗传分析表明,禾谷镰刀菌cAMP受体类型的GPCR蛋白与假禾谷镰刀菌及F.langsethiae同源性最高,亲缘关系最近。本研究明确了禾谷镰刀菌中cAMP类GPCR蛋白的理化性质、定位、二级结构、磷酸化位点及进化关系,为了解小麦赤霉病发病机制及以GPCRs为靶标的新型杀菌剂研发奠定了基础。     

全基因组预测希金斯炭疽菌的候选效应分子

[目的]希金斯炭疽菌可以侵染十字花科诸多植物引起炭疽病,给各国农业生产造成了巨大经济损失。对该菌候选效应分子进行预测,并对其特征进行明确。[方法]利用Signal P、Prot Comp等程序对该菌中分泌蛋白进行找寻,并对分泌蛋白所具有的氨基酸大小、信号肽长度以及理化性质等进行分析。结合已经报道的真菌效应分子具有的典型特征,明确该菌存在的候选效应分子数量及特征。[结果]希金斯炭疽菌含有658个分泌蛋白,氨基酸长度集中于50~300 aa之间;信号肽长度以17~21个aa的序列最为集中;信号肽切割位点属于A-X-A类型;分泌蛋白在分子量、等电点、不稳定系数等方面均存在差异,但大多数分泌蛋白属于亲水性蛋白。其中,预测功能的蛋白为290个,其功能较多的集中于酶类,包括脂肪酶、α-L-鼠李糖苷酶、果胶酯酶等。依据候选效应分子典型特征,明确该菌中含有388个候选效应分子。[结论]通过上述生物信息学分析方法,结合真菌效应分子典型特征,有效地实现了希金斯炭疽菌候选效应分子的预测,其信号肽切割位点类型与其他已经报道的致病疫霉、粗糙脉孢霉等分泌蛋白信号肽切割位点一致,分泌蛋白功能涉及较多的酶类,也与其他已经报道的病菌分泌蛋白功能相类似。     

酿酒酵母中钙信号途径对crz1调控基因表达的影响

该文通过对酿酒酵母细胞中120个钙离子敏感性基因的启动子进行序列分析发现,24个基因的启动子上含有转录因子Crz1的结合位点(GNG GC[T/G]CA或GNG GCT G)。该研究检测了钙信号途径对24个基因表达和细胞定位的影响。实验结果表明,钙信号途径通过转录因子Crz1诱导19个基因的特异性表达及其编码蛋白的细胞定位。结果发现,5个基因的功能与代谢相关(TPS1、PHO86、ERG3、ARG82和AKR1)、5个基因的功能与离子稳态相关(CSG2、PMC1、VMA10、MNR2和VAM2)、4个基因的功能与蛋白质分选相关(PEP3、VPS36、VPS27和VPS4)以及5个基因的功能与转录相关(DEP1、IMP2′、THP1、SGF29和ROX3)。该文的研究结果为研究酿酒酵母细胞中钙离子稳态调控机制提供了理论基础。     

人线粒体转录延伸因子蛋白结构与功能的生物信息学分析

[目的]基于生物信息学方法分析人线粒体转录延伸因子TEFM蛋白的结构和功能。[方法]检索Uniprot数据库中人线粒体转录终止因子TEFM蛋白的氨基酸序列,利用生物信息学方法对人TEFM的理化性质、物种间的蛋白质同源性、跨膜区、亲水性/疏水性、亚细胞定位、蛋白质二级结构、保守结构域、蛋白质三级结构、蛋白质相互作用进行预测与分析。[结果]人TEFM全长360个氨基酸,理论等电点9.39,属于TEFM蛋白超家族,不含跨膜区,属于亲水蛋白;人TEFM含有一个保守的螺旋-发夹-螺旋(HHH_3)结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三维建模空间结构与二级结构预测结果相符,进一步分析建模结果可靠。与人TEFM相互作用的蛋白质均为线粒体DNA转录因子或线粒体RNA聚合酶。[结论]人TEFM具有线粒体转录延伸因子蛋白超家族的典型结构,生物信息学分析结果对深入研究人TEFM在线粒体基因转录调控中的作用具有一定的理论指导意义。     

赭曲霉G蛋白偶联受体的鉴定及生物信息学分析

【目的】预测并分析赭曲霉(Aspergillus ochraceus)中存在的G蛋白偶联受体(G-protein- coupled receptors,GPCRs)的结构特征和理化性质,探究赭曲霉GPCR超家族蛋白的结构及所接收配体的聚类情况以及与其他同源蛋白的进化关系,为深入开展赭曲霉中GPCRs的定位、功能研究提供理论基础,也有望从G蛋白信号途径角度抑制赭曲霉毒素的产生,进一步控制粮食的真菌毒素污染。【方法】基于已经报道的曲霉属典型GPCRs序列,在赭曲霉全基因组中进行BLASTp比对以获取候选GPCRs蛋白。通过SMART及多种软件进行保守结构域,特别是跨膜结构的分析,进一步分析候选序列的理化性质、信号肽、二级结构及亚细胞定位等特征。最后,利用MEGA构建赭曲霉中GPCRs与同源蛋白的系统发育树进行遗传关系的比较。【结果】明确赭曲霉存在 15个具有典型7次跨膜结构的GPCRs蛋白,不存在信号肽及转运肽,均含有较高比例的α螺旋结构,15个蛋白质中有7个定位在细胞膜。赭曲霉中的GPCRs与黄曲霉等曲霉属中相应的同源序列具有较近的亲缘关系。【结论】本研究首次对赭曲霉的GPCR超蛋白家族进行了预测,分析其结构及理化性质,探讨了其与同源蛋白的聚类情况,为深入开展赭曲霉GPCRs的功能研究提供理论基础。     

褐环乳牛肝菌磷酸盐转运蛋白PHO84的生物信息学分析

[目的]褐环乳牛肝菌作为针叶树种上重要的外生真菌,为宿主植物提供着重要的营养元素和水分,然而,对于该菌为宿主植物提供磷营养元素的机制尚不清楚。磷酸盐转运蛋白PHO84参与磷酸盐的调控系统,在磷酸盐转运过程以及细胞信号转导过程中发挥着重要作用。[方法]基于酿酒酵母中已经报道的PHO84序列,对褐环乳牛肝菌蛋白质数据库进行Blastp比对以及关键词搜索,以及生物信息学分析。[结果]该菌中存在3个PHO84,上述PHO84含有9~12不等的跨膜结构域,均为疏水性蛋白,均定位于细胞质膜上。[结论]该研究为进一步解析外生真菌为宿主植物提供磷营养的机制提供理论支持,也为进一步开展其他磷酸盐转运蛋白的研究提供理论指导。     

基于CRISPR-Cas9技术构建橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统

[背景]CRISPR-Cas9基因组编辑技术为病原真菌的基因敲除、敲入及定点编辑提供了新的思路。[目的]建立适用于橡胶树胶孢炭疽菌的CRISPR-Cas9基因敲除系统。[方法]通过大肠杆菌原核表达系统合成含有细胞核定位信号的Cas9蛋白;以URA5为靶标基因,预测该基因中Cas9的切割位点,并在体外转录合成相应的SgRNA;体外构建Cas9-SgRNA复合体,并将该复合体转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体;通过表型筛选及测序鉴定,筛选URA5的敲除突变体菌株。[结果]体外表达的Cas9蛋白与SgRNA能够形成复合体,并在体外对目标基因URA5的DNA序列进行切割;Cas9-SgRNA复合体能够成功转入橡胶树胶孢炭疽菌原生质体,并完成对URA5的敲除;敲除突变株表现出尿嘧啶缺陷表现型。[结论]建立了适用于橡胶树胶孢炭疽菌的基因敲除系统。     

人CREB1基因及蛋白的生物信息学分析

[目的]利用生物信息学方法预测分析人CREB1基因的启动子情况及蛋白质的理化性质、亲疏水性、细胞亚定位、蛋白质多级结构、与之相互作用的蛋白质以及GO注释。[方法]利用相应软件及网站预测分析CREB1基因及其蛋白的相关信息。[结果]发现CREB1基因存在4个启动子,其转录受SP1和AP-2影响较大;其蛋白质是由431个氨基酸组成的主要定位于细胞核的不稳定亲水蛋白,其等电点为5.44,序列在多个物种间保守性强;二级结构主要由α螺旋和无规卷曲;需要更多可靠的模板构建三级结构;CREB1调控由c AMP介导的信号通路,对神经系统疾病及肿瘤的发生发展有重要作用。[结论]SP1和AP2通过调控多个启动子影响CREB1的表达,其蛋白质主要定位于细胞核,通过调控c AMP介导的信号通路维持人体正常生理状态。     

拟南芥类受体胞质激酶RBK2的生物信息学分析

[目的]对拟南芥类受体胞质激酶RBK2(ROP binding protein kinases 2)的结构、分子进化和基因表达等进行预测分析。[方法]利用生物信息学在线相关数据库和分析软件对目的蛋白的基本理化性质、二级及三级结构、同源性、基因表达、蛋白定位、相互作用蛋白进行分析预测。[结果]拟南芥类受体胞质激酶RBK2是一个亲水性不稳定蛋白,主要构成原件为α螺旋及β片状折叠,进化树构建及多序列比对显示其与琴叶拟南芥中名为激酶家族蛋白的蛋白进化距离最近。主要存在于细胞质和细胞核中,其编码基因在成熟花粉中强烈表达,且RBK2与PP2C家族蛋白有较强的相互作用。[结论]拟南芥RBK2很可能通过参与信号转导途径在植物种子萌发、花粉成熟及细胞分裂等方面发挥重要作用。     

藏药黑紫獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因克隆及生物信息学分析

[目的]对藏药黑紫獐牙菜香叶醇-10羟化酶(geraniol 10-hydroxylase,G10H)基因分子克隆和生物信息学分析。[方法]采用PCR方法扩增并克隆了藏药黑紫獐牙菜香叶醇-10羟化酶基因,再用DNAMAN、Mega等生物软件以及TMHMM Server.v.2.0、Prot Scale等在线软件对该基因进行了生物信息学分析。[结果]所得G10H基因总长为1 488 bp,编码495个氨基酸(Gen Bank accession KR709239),无信号肽,部分跨膜,蛋白质二级结构主要以α螺旋(22个)、β折叠(8个)为主,黑紫獐牙菜G10H与9个物种氨基酸序列具有高度的同源性。[结论]该酶N端无信号肽,为非分泌蛋白。G10H酶要实现其功能,在核苷酸和氨基酸水平上必须具有相当的保守性。     

双功能域β-折叠桶碱性植酸酶蛋白序列分析与酶学特性

【目的】表达、纯化来源于Bacillus sp.HJB17的双功能域β-折叠桶碱性植酸酶(phy HT),并对该酶进行蛋白序列以及酶学特征分析,为该酶的广泛应用奠定基础。【方法】应用生物信息学技术,对phy HT蛋白序列进行了生物信息学分析。表达、变复性、分离纯化得到具有酶活性的可溶性phy HT蛋白溶液,通过硫酸亚铁-钼蓝法对phy HT的酶学特性进行了研究。【结果】序列分析结果显示,phy HT由633个氨基酸组成,含有2个植酸酶结构域,属于典型的BPP植酸酶,相对分子量(MW)为69321.68 Da,理论等电点为5.37,为亲水性蛋白。二级结构中,phy HT中α-螺旋(helix)、β-片层(sheet)占主要的比例,高级结构以β片层形成的桶状结构为主。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为35°C,在45°C以下比较稳定。最适的p H为8.0,在p H为6.0–12.0条件之间比较稳定。低浓度的Ca~(2+)以及Mg~(2+)对酶活性有促进作用,Fe~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)等金属离子对酶活性有抑制作用。【结论】本研究成功对phy HT进行了蛋白序列分析以及酶学性质研究,phy HT属于碱性植酸酶,酶活性高、稳定性好,在理论研究和工业生产方面均有很大应用价值。     

小叶章PPDK基因的克隆和生物信息学分析

[目的]获得小叶章PPDK的cDNA序列,推测蛋白氨基酸理化性质及二三级结构等,以及已知物种PPDK氨基酸系统进化分析。[方法]利用RT-PCR技术扩增PPDK序列,通过ProtParam、Blast、THMHMM、SOPMA等生物信息软件分析序列。[结果]获得了小叶章PPDK的c DNA序列,长1 035 bp,相对分子量41. 910 kDa,等电点为9. 70,氨基酸中含量最高的是丝氨酸,72个;蛋白二级结构中无规卷曲占48. 83%,不含信号肽和跨膜结构,氨基酸系统进化树结果分析发现小叶章PPDK与二穗短柄草、水稻亲缘关系最近。[结论]小叶章PPDK含有385个氨基酸,含1个PDRP活性调控位点,72个参与信号传导的磷酸化位点。     

SM22-α蛋白结构与功能的生物信息学分析

[目的]通过生物信息学分析手段对SM22-α蛋白结构与作用进行系统性分析。[方法]从NCBI数据库中获取SM22-α蛋白的基本信息,应用NCBI GenBank、ExPAsy、TMHMM Server v.2.0、NetPhos 3.1 Server、IEDB、SIGNALP 5.0 Server等生物信息学分析软件对SM22-α蛋白的氨基酸序列、理化性质、跨膜结构、亲水/疏水性、功能位点、信号肽、序列同源性、糖基化和磷酸化位点、空间结构以及抗原表位进行分析。[结果]SM22-α蛋白编码201个氨基酸,为碱性蛋白,其等电点为8.85,不稳定指数为31.85,并将其归为稳定蛋白。其平均亲水系数为-0.607,为亲水性蛋白。根据IEDB在线软件发现SM22-α蛋白序列的第4-31、39-50、70-89、105-111、116-122、138-197存在B细胞抗原表位。利用HLA-A*0.2:0.1算法预测SM22-α蛋白序列第61和130位序列表面存在2个T细胞抗原表位;若利用HLA-DRBI*0401算法预测则第142位序列存在1个T细胞抗原表位。SM22-α蛋白的二级结构中α螺旋占46.77%,延伸链占6.47%,β-转角占4.48%,无规则卷曲占42.29%。且通过生物信息学分析可知SM22-α蛋白在不同物种之间的同源性为97.0%~68.7%。[结论]SM22-α为碱性、稳定、亲水性胞外蛋白,且蛋白表面含有T、B细胞抗原表位,可为其抗原性药物研究提供理论参考。     

红色毛癣菌pho88基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)无机磷酸盐转运蛋白(Inorganic phosphate transporter,PHO88)基因,构建原核表达质粒,并对PHO88蛋白进行生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的T. rubrum CBS 118892菌株pho88基因序列(XP-003235348),设计合成特异性引物,提取红色毛癣菌总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增pho88基因,构建到原核表达载体p ET-28a上,测序鉴定其序列,并对其进行生物信息学分析。[结果]红色毛癣菌pho88基因全长582 bp,编码193个氨基酸。PHO88蛋白含有1个跨膜结构域,细胞亚定位为分泌信号途径蛋白,PHO88含有16个磷酸化修饰位点,其二级结构主要由α-螺旋构成,高级结构为全α型蛋白质。[结论]成功克隆红色毛癣菌pho88基因及构建原核表达质粒,为后续PHO88蛋白的诱导表达奠定基础,为后续开发靶向PHO88的抗真菌药物,提供实验基础。     

酿酒酵母W5核酸内切酶基因HO的克隆及生物信息学分析

目的:以酿酒酵母W5为出发菌株,对其核酸内切酶基因HO进行克隆及生物信息学分析。方法:首先运用Primer 5.0软件,设计一对扩增HO基因序列的引物,并以酿酒酵母W5全基因组为模板进行PCR扩增,获得酿酒酵母W5核酸内切酶HO基因片段,利用生物信息学技术对该序列进行验证及分析。结果:测序显示HO基因长度为1760bp,无碱基缺失,且该基因序列具有完整的开放读框。该基因编码的HO蛋白包含586个氨基酸残基,强酸性和强碱性氨基酸残基数量有明显差异;HO蛋白等电点为9.56,存在激酶位点,疏水性最大值为1.722,亚细胞定位预测其位于细胞核内,属于碱性胞内蛋白质,并构建了其空间结构模型。结论:对酿酒酵母W5核酸内切酶HO基因序列进行了克隆及生物信息学分析,所得数据可为酿酒酵母遗传背景研究提供一定的理论支持。