抗凝活性肽RGD226基因构建、表达、产物纯化及活性分析

通过PCR法 ,将来源于蛇毒蛋白质eristostatin中的一段含有RGD(Arg Gly Asp)序列的十三肽(SRVARGDWNDDYS)的基因 ,以一个无胰岛素活性但保留天然免疫原性的胰岛素原突变体(PJG4 0 1)基因为模板 ,置换其B2 8和A1位之间的连接肽基因 ,构建成了能展示RGD功能序列的人源化分子 (RGD2 2 6 )的基因 .通过该基因在大肠杆菌中的表达、产物分离纯化 ,得到高纯度RGD2 2 6 .该RGD肽对由ADP诱导的体外人血小板聚集的半抑制浓度IC50 为 2 2 3μmol L .其胰岛素免疫活性是PJG4 0 1的 15 1% ,提示其在一定程度上保留了胰岛素原的免疫原性 .其受体结合活性不到PJG4 0 1的 0 1% ,说明其胰岛素的生物活性基本丧失 .动物实验证实 ,RGD2 2 6在延长小鼠出血时间上具有较明显的作用     

高分子量激肽原富含组氨酸区域抑制细胞伸展的机制分析

活化型高分子量激肽原 (activehighmolecularweightkininogen ,HKa)是组织培养板上体外连接蛋白 (vitronectin ,VN)促使细胞伸展的潜在抑制物 ,已证实轻链的富含组氨酸区域 (histidine richdomain ,HRD)是HKa抗细胞伸展的活性区域 .HK的重组HRD (r HRD)能够促使成纤维细胞伸展 .通过基于HRD序列的选择肽分析 ,定位了HRD的细胞伸展序列 .5个肽中的 3个能够使TIG 3细胞伸展 .P 1肽引起的细胞伸展能够被可溶性P 5肽或HKa所抑制 .P 2肽不能抑制P 1或P 5肽引起的细胞伸展 .r HRD以及 3种肽介导的细胞伸展能够被RGD合成肽以及抗αvβ3或α5β1整合素抗体所抑制 .结果提示 ,选择肽引起的细胞伸展是由整合素介导的 ,尽管此区域不含有RGD序列     

表面等离激元共振生物传感器研究整合素蛋白αⅡbβ3与RGD多肽的特异结合

整合素蛋白αⅡbβ3是血小板上的一种钙依赖性膜受体,其胞外结构域可与含有RGD序列的肽链特异结合.通过将含有NTA-DOGS的磷脂单分子层膜转移到50 nm厚的金膜上,制备了一种含有NTA头部的表面等离激元共振(SPR)传感器敏感膜.设计并合成了含有6个组氨酸和RGD基团的His-tagged短肽P1,并利用SPR生物传感器,对整合素蛋白与含有RGD配基的支撑平面膜的特异相互作用以及Ca2+、Mn2+对该相互作用的影响进行了研究.结果表明,NTA敏感膜能很好地将P1锚定在支撑平面膜表面,并能够保证P1维持一个有效的定向.将Ca2+从低结合位点去除或加入Mn2+都能够增加整合素蛋白的配基结合活性.二价阳离子对整合素蛋白配基结合能力的调节作用,可能在整合素发挥其生理功能的过程中具有重要的意义.     

含RGD三肽的骨基质非胶原蛋白在骨质疏松症中的研究进展

骨基质非胶原蛋白是对于骨的生长、再生、发育等有重要作用的蛋白质,其中包含一类在结构上都含有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)三肽的蛋白.近来研究表明,RGD蛋白在骨基质的形成、矿化,以及介导细胞.细胞、细胞-基质的相互作用中发挥关键作用.本文对骨基质中主要的RGD蛋白的骨生物活性,以及与骨质疏松症关系方面的最新研究进展作一简述.     

RGD三肽的潜在作用靶标预测与计算机模拟分析

化学基因组技术是药物作用靶标确认、药物分子在通路中的作用的确证等方面有重要应用,可为新药研发和老药新用提供理论依据,并可降低药物发现中的高额成本.精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽被证明是与细胞粘附受体特异性结合的特征序列,在生理学上扮演者重要角色.本研究利用化学基因组学中的其中一种方法即基于反向对接和药效团反向匹配搜索技术来研究RGD三肽的潜在作用靶标,并进行计算机模拟分析.反向匹配搜索结果发现计算得到的关键性靶标及其涉及的相关疾病与实验报道的RGD的药理活性相吻合,包括具有抗凝血、抗肿瘤作用,与肾及心血管作用有关等,而且还发现RGD可能是一个潜在的神经氨酸酶的抑制剂.     

RGD肽对肺癌A549 细胞增殖侵袭能力的影响及其机制研究

目的:研究RGD肽对肺癌A549细胞增殖凋亡及侵袭迁移的影响,并探讨其作用机制。方法:不同浓度RGD肽处理肺癌A549细胞后,MTT检测肺癌细胞的增殖能力,流式细胞仪检测肺癌细胞凋亡及周期分布,Transwell检测其迁移及侵袭能力的变化,Western blot检测RGD肽对肺癌A549细胞MMP2、MMP9的表达水平影响。结果:当RGD肽浓度增加至50 mg/L时,肺癌A549细胞增殖明显受到抑制,且这种抑制作用呈剂量依赖关系;RGD肽组A549细胞G0/G1期细胞比例增高,细胞凋亡率由(6.1±0.1)%增至(15.2±0.5)%;在迁移和侵袭试验中,RGD肽组A549细胞的穿膜细胞数分别由123±10和43±10降至45±5和18±5;RGD肽组A549细胞MMP2、MMP9表达水平显著降低。结论:RGD肽对肺癌A549细胞的增殖有明显抑制作用,并促进其凋亡,可能与RGD肽改变其周期分布有关,RGD肽可明显抑制A549细胞的迁移及侵袭,可能与其下调MMP2、MMP9的表达相关。     

小鼠外胎盘锥细胞与层粘连蛋白相互作用机制的研究

本文用LN及含其活性位点序列的合成肽段cYIGSR和RGDS对小鼠EPC细胞与LN的相互作用机制进行研究。结果表明:合成肽段cYIGSR和RGDS能促进EPC粘附并具协同效应。cYIGSR还能促进EPC扩展与次生TGCs迁移。LNA链上RGD和B_1链上YIGSR两个活性位点协同地参与了LN对EPC的粘附、扩展以及次生TGCs的迁移的促进作用。cY R合用不能完全竞争性抑制EPC与LN的结合,说明还有其他作用位点存在。     

表面等离激元共振生物传感器研究整合素蛋白αⅡbβ3与RGD多肽的特异结合

整合素蛋白α_Ⅱbβ₃是血小板上的一种钙依赖性膜受体,其胞外结构域可与含有RGD序列的肽链特异结合.通过将含有NTA-DOGS的磷脂单分子层膜转移到50 nm厚的金膜上,制备了一种含有NTA头部的表面等离激元共振(SPR)传感器敏感膜.设计并合成了含有6个组氨酸和RGD基团的His-tagged短肽P1,并利用SPR生物传感器,对整合素蛋白与含有RGD配基的支撑平面膜的特异相互作用以及Ca²⁺、Mn²⁺对该相互作用的影响进行了研究.结果表明,NTA敏感膜能很好地将P1锚定在支撑平面膜表面,并能够保证P1维持一个有效的定向.将Ca²⁺从低结合位点去除或加入Mn²⁺都能够增加整合素蛋白的配基结合活性.二价阳离子对整合素蛋白配基结合能力的调节作用,可能在整合素发挥其生理功能的过程中具有重要的意义.     

骨桥蛋白RGD黏附序列多拷贝短肽的表达、纯化及生物学活性测定

目的:用大肠杆菌表达骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽,经分离纯化后检测其生物学活性.方法:运用基因重组技术,将骨桥蛋白RGD黏附序列的核酸片段首尾相连,与携带GST编码序列的原核表达载体连接构建融合蛋白表达质粒pGEX-3X-RGD.将重组质粒转化宿主菌后,对诱导融合蛋白表达的条件进行优化.表达产物GST-RGD经谷胱甘肽-亲和层析纯化后,分别检测其对骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移的影响.结果:所构建的含有6个拷贝短肽的GST-RGD融合蛋白可在大肠杆菌中以包含体的形式进行表达.用十二烷基肌氨酸钠变性溶解包含体及透析复性后,经亲和层析可得到高纯度的GST-RGD(6)融合蛋白.GST-RGD(6)融合蛋白能特异性的抑制骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞的黏附和迁移.结论:骨桥蛋白RGD黏附序列6拷贝短肽可在大肠杆菌中高效表达,纯化的GST-RGD融合蛋白具有抑制血管平滑肌细胞黏附和迁移的活性.     

日本七鳃鳗Arg-Gly-Asp毒素蛋白Lj-RGD3野生型与RGD全缺失突变体Lj-112的抗血管新生作用

七鳃鳗Arg-Gly-Asp (RGD) 毒素肽Lj-RGD3与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性,而RGD毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性,但作用靶点不同。为研究Lj-RGD3结构与功能的关系,对野生型Lj-RGD3及其RGD全缺失突变体Lj-112进行了抗血管新生功能研究。将3个RGD模体的全缺失突变体基因Lj-112全序列合成后构建于pET-23b载体,对野生型Lj-RGD3及突变体 Lj-112蛋白进行IPTG诱导表达,重组蛋白经组氨酸亲和层析纯化;采用MTT法测定野生型和突变体蛋白对人