果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 680个,其中上调表达基因有1 181个,下调表达基因有1 499个。Gene Ontology 功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。     

组蛋白去乙酰化酶CfSnt2调控果生刺盘孢生长发育和致病力

炭疽病是油茶Camellia oleifera的重要病害,该病害的优势致病菌是刺盘孢属Colletotrichum的果生刺盘孢C. fructicola,在全国的油茶产区普遍发生。我们前期发现组蛋白乙酰转移酶CfGcn5调控油茶果生刺盘孢的生长发育和致病过程,但组蛋白去乙酰化酶在该病菌中的生物学功能尚不清楚。本研究以组蛋白去乙酰化酶CfSnt2为研究对象,利用反向遗传学的方法,通过对野生型、CfSNT2基因敲除突变体及互补菌株的生物学表型进行比较分析,发现CfSNT2基因敲除突变体的菌丝生长速率明显减缓、分生孢子的产量显著减少、附着胞形成率降低、对细胞壁胁迫剂的响应异常,同时对油茶致病力显著减弱。以上现象说明CfSnt2调控果生刺盘孢的生长、产孢、附着胞的形成、对细胞壁完整性胁迫剂的耐受性及致病力。     

自噬相关蛋白CfAtg8在果生刺盘孢中的功能分析

油茶炭疽病是由刺盘孢属Colletotrichum真菌引起的重要病害,在中国各油茶产区均有发生,严重威胁茶油的产量与品质。前期发现果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病的优势致病菌,自噬相关蛋白Atg8在果生刺盘孢中的生物学功能尚不清楚。本研究根据同源重组的原理及PEG介导的原生质体转化方法,获得了CfATG8基因敲除突变体及其互补菌株。进一步通过生物学表型分析,发现突变体生长减慢、产孢量减少、附着胞形成率降低、对细胞壁完整性胁迫耐受性降低,并且丧失对油茶的致病性。上述结果表明,CfAtg8参与调控果生刺盘孢的营养生长、无性繁殖、附着胞形成、对外界胁迫应答及致病过程。     

液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢的生长发育和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要流行致病菌。本文研究果生刺盘孢中液泡分选蛋白CfVps17的生物学功能,为阐明该蛋白调控致病分子机制提供依据。采用over-lap方法构建CfVPS17基因敲除载体片段,使用PEG介导法将敲除载体片段转化至果生刺盘孢原生质体中,通过验证筛选获得突变体菌株ΔCfvps17。构建目的基因CfVPS17回补载体pYF11::CfVPS17,经转化获得ΔCfvps17-C回补菌株。测定野生型、突变体ΔCfvps17及回补菌株ΔCfvps17-C的生物学表型,结果表明,与野生型和回补菌株相比,突变体ΔCfvps17菌丝生长速率、产孢量和附着胞形成率显著降低,突变体菌丝中糖原积累减少,对氯化钠和刚果红胁迫耐受性增强;致病力测定结果表明,突变体ΔCfvps17丧失了对油茶叶片的致病力。液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢糖原积累、生长发育、外界胁迫应答和致病力。     

CfNop12参与调控果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要致病菌。研究果生刺盘孢RNA结合蛋白基因CfNOP12的生物学功能,阐述果生刺盘孢致病的分子机制,为油茶炭疽病的防治提供理论基础。根据同源重组原理,在果生刺盘孢中敲除目标基因CfNOP12,PCR验证获得正确的突变体ΔCfnop12;进一步构建PYF11::CfNOP12回补质粒,导入突变体原生质体中,筛选成功互补菌株ΔCfnop12-C。对这些菌株进行生物学表型测定,发现突变体ΔCfnop12营养生长速率显著下降,分生孢子的产量及附着胞形成率显著降低;在含有细胞壁胁迫剂的PDA培养基上,突变体ΔCfnop12的抑制率相较于野生型和回补菌株显著升高,在低温条件下,突变体的生长速率表现出明显下降;野生型和回补菌株几丁质聚集在菌丝顶端,突变体ΔCfnop12尖端几丁质分布不正常;相比于野生型和回补菌株,突变体致病力显著降低。综上所述,潜在RNA结合蛋白基因CfNOP12参与调控了果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力。     

基于Cfku70基因失活策略构建果生刺盘孢的高效基因敲除底盘菌株

果生刺盘孢侵染危害多种植物,是重要的植物病原真菌。在一些丝状真菌中,敲除非同源末端连接修复通路的关键基因ku70或ku80可显著提高同源重组效率,进而提高靶基因置换频率。本研究从果生刺盘孢基因组鉴定到Cfku70和Cfku80两个基因,并明确了基因失活对菌株生物学表型和基因敲除效率的影响。敲除Cfku70或Cfku80不影响菌株的菌落形态、营养生长、产孢、分生孢子萌发、侵染结构发育和致病;Cfku70基因敲除还大幅提升3个测试基因的敲除效率。本研究证实Cfku70基因失活能显著提高果生刺盘孢的基因敲除效率,适宜作为高效基因敲除的底盘菌株,研究结果为通过批量敲除策略筛选新型致病因子奠定重要基础。     

果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因Cfcyp450的功能

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola能够引起苹果炭疽叶枯病和苹果苦腐病。前期通过基因组分析发现一个叶枯型C. fructicola菌株特异基因Cfcyp450。本研究对其功能进行分析,以明确其在致病中的作用。采用同源重组方法获得了敲除突变体。表型分析显示,Cfcyp450敲除突变体与野生型生长速率无明显差别,但敲除突变体菌落变白;与野生型相比,突变体附着胞形成降低30.02%;侵染钉延伸菌丝对玻璃纸的穿透率下降41.19%。致病性测定显示,突变体对嘎啦叶片致病力显著下降。生物信息学分析显示,Cfcyp450仅存在于叶枯型菌株中,同时与烟草和拟南芥内生菌同源性较高,但与刺盘孢属物种亲缘关系较远。这些结果表明果生刺盘孢Cfcyp450基因为叶枯型菌株的关键致病因子,可能通过水平转移获得。     

油茶果生刺盘孢组蛋白乙酰化转移酶Rtt109生物学功能

炭疽病是油茶的主要病害,造成巨大经济损失。果生刺盘孢是油茶炭疽病优势致病菌。本研究旨在探讨果生刺盘孢中组蛋白乙酰化转移酶Rtt109的生物学功能,为油茶炭疽病防治提供理论依据。通过构建基因敲除载体,根据同源重组原理,敲除目标基因CfRTT109,进一步筛选获得突变体ΔCfrtt109;构建CfRTT109基因回补质粒,转化至突变体ΔCfrtt109,通过荧光筛选回补菌株。生物学表型测定结果显示：相比于野生型,突变体ΔCfrtt109生长速率下降了51.23%,分生孢子的形成率下降了71.89%;在含有5.0mmol/L内质网胁迫剂二硫苏糖醇的PDA培养基中,突变体ΔCfrtt109的生长抑制率为50.75%,显著高于野生型和回补菌株;荧光定量PCR结果表明,与野生型和回补菌株相比,内质网相关的基因HAC1、SCJ1与PDI1基因在突变体中显著上调表达;在含有DNA损伤试剂甲基磺酸甲酯的PDA培养基中,突变体ΔCfrtt109停止生长;进一步研究发现,在甲基磺酸甲酯胁迫下,突变体ΔCfrtt109中的DNA损伤修复基因RHM52、RHM54与REV1表达量上调幅度显著低于野生型;致病力测...     

CfAtg8在调控果生刺盘孢正负菌株分化中的功能

由果生刺盘孢Colletotrichum fructicola引起的炭疽叶枯病严重危害苹果果实和叶片。刺盘孢属真菌可以产生具有形态和遗传差异的正型(+)和负型(-)菌株,但其分化的分子机制目前尚不清楚。本研究通过同源重组对CfAtg8功能进行分析,结果显示,CfAtg8显著影响果生刺盘孢正菌株(1104-7)菌落颜色和气生菌丝茂密程度,但不影响负菌株(1104-6);正菌株突变体不产生子囊壳,负菌株突变体子囊壳变小、数量增多;正菌株突变体与负菌株野生型1104-6杂交不形成交配线,负菌株突变体与正菌株野生型1104-7杂交形成正常交配线;此外,CfAtg8还影响正、负菌株分生孢子萌发、附着胞形成及致病性等。这些结果表明自噬基因CfAtg8是影响果生刺盘孢正负菌株分化、形态发育和致病的重要基因。     

基因CfATG6和CfATG14参与调控果生刺盘孢细胞自噬和致病力

【目的】炭疽病是油茶的主要病害,由刺盘孢属的多种真菌引起,其中果生刺盘孢分布范围最广、分离率最高,是油茶炭疽病的主要致病菌。研究自噬相关蛋白CfAtg6和CfAtg14的生物学功能,为进一步揭示果生刺盘孢通过细胞自噬调控致病的分子机制,并为油茶炭疽病的防治提供理论基础。【方法】根据同源重组原理,通过聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介导的方法,在果生刺盘孢中敲除基因CfATG6和CfATG14,并进一步获得回补菌株ΔCfatg6-C和ΔCfatg14-C。【结果】酵母双杂交试验结果显示,果生刺盘孢蛋白CfAtg6和CfAtg14可能存在互作关系。生物学表型测定结果表明,相较于野生型和回补菌株,突变体ΔCfatg6和ΔCfatg14均表现出营养生长速率显著减慢,附着胞形成率分别只有野生型的5%和18%;突变体ΔCfatg6和ΔCfatg14致病力均极显著减弱,造成的油茶叶片病斑面积少于野生型和回补菌株的1/3;CfATG6和CfATG14基因缺失突变体均丧失转运和降解CfAtg8蛋白的能力,并对细胞壁胁迫更敏感。突变体ΔCfatg6的分生孢子产量显著降低,仅为野生型的20%左右;氧化胁迫试验结果表明,相较于野生型和回补菌株,过氧化氢对突变体的生长抑制率升高10%左右。内质网压力胁迫试验表明,ΔCfatg14对二硫苏糖醇抑制率升高5%以上。【结论】自噬相关基因CfATG6和CfATG14参与调控了果生刺盘孢生长发育、细胞自噬和致病力。     

基于生态位模型预测野生油茶的潜在分布

油茶(Camellia oleifera)是我国第一大木本油料作物, 野生油茶是油茶育种的宝贵遗传资源。本研究从中国数字植物标本馆(CVH, http://www.cvh.org.cn/)获得可靠的野生油茶分布点数据, 结合气象和土壤数据, 分别应用最大熵(MaxEnt)模型和规则集遗传算法(GARP)模型构建了野生油茶的生态位模型, 预测了野生油茶的潜在分布区, 并分析了影响野生油茶分布的主要环境变量。根据生态位模型预测的分布概率值, 对野生油茶的潜在分布区划分适生等级, 并与主要油茶产地的实际分布数据进行比较, 以验证适生等级划分的可靠性。结果表明, 两种模型的预测结果均能较好地反映油茶的分布情况。GARP模型预测的潜在分布区更广, 而MaxEnt模型的预测结果更精确。两种模型的预测结果均显示, 野生油茶的潜在分布区大部分位于中国, 但在中南半岛也有部分分布。MaxEnt模型预测的野生油茶在中国的潜在分布区与我国亚热带常绿阔叶林的分布区基本吻合, 高适生区主要可以分为3大区域: (1)东北-西南走向的武夷山脉及附近的群山区域; (2)东西走向的南岭山脉及附近的群山区域; (3)东北-西南走向的武陵山脉及附近的群山区域。MaxEnt模型分析显示, 影响野生油茶分布的主要环境变量是昼夜温差月均值、最干季降水量与最暖季降水量。油茶生长面积较大的地区绝大部分都位于MaxEnt模型预测的中、高适生区, 说明适生等级的划分较可靠。实地考察显示, 生态位模型的预测结果对于寻找野生油茶资源具有较高的参考价值。此外, 本研究也充分显示, 利用中国数字植物标本馆的植物分布数据, 结合相应的环境数据构建生态位模型, 有助于了解作物野生近缘种的地理分布。     

基于多尺度标记优化分水岭方法的油茶冠幅提取

针对尺度对地物空间结构的限制以及传统分水岭分割易产生树冠过分割等问题,选择长沙县明月村油茶基地为研究区,提出一种基于多尺度标记优化分水岭分割油茶树冠的方法。首先使用高分辨率无人机影像采集图像,分析影像特征,构建油茶分类体系,提取油茶林分布区域。其次,运用多尺度区域迭代增长方法提取树冠标记,将标记应用于多阈值尺度的分水岭变换,并结合Johnson指数选取树冠标记增长和分水岭阈值的最优尺度,实现油茶单木的准确识别。结果表明:多尺度标记优化分水岭方法在分离油茶单木时,树冠面积提取值与目视解译参考值的相对误差为9.4%;单木总体识别精度为89.4%,相对于传统的分水岭分割方法精度提高了34.8%;通过Johnson指数确定的最优迭代增长尺度为20,分水岭分割阈值尺度为85,对比不同尺度组合下的油茶冠幅提取结果,最优尺度下的油茶冠幅提取精度最高(R²=0.75)。多尺度标记优化分水岭方法能较准确地分离油茶树冠,将该方法应用于无人机影像树冠分割,可有效提高经济林调查的效率。     

亚热带红壤侵蚀区马尾松不同套种模式生态系统碳平衡

以福建省长汀县红壤侵蚀区马尾松低效林套种杨梅、无患子、油茶及黄栀子的改造模式林分为研究对象,对林分各组分生物量年净生长量、含碳率及土壤异养呼吸进行定位观测,分析套种模式对低效马尾松林分生态系统碳储量格局及碳平衡的影响。结果表明: 杨梅、无患子、油茶、黄栀子和马尾松不同器官含碳率的变化范围分别为41.1%～50.1%、42.2%～50.6%、45.1%～48.9%、44.7%～49.6%和46.1%～51.9%。不同树种同一器官之间的含碳率存在显著差异。马尾松套种杨梅及马尾松套种无患子模式植被层碳储量及年净增碳储量最高,分别为67.62～68.42 t·hm^-2和9.21～9.45 t·hm^-2·a^-1,马尾松套种油茶和马尾松套种黄栀子模式较小,分别为31.96～36.24 t·hm^-2和4.09～4.16 t·hm^-2·a^-1,马尾松纯林对照最小,分别为17.01 t·hm^-2和2.00 t·hm^-2·a^-1。土壤异养呼吸年通量从高到低依次为马尾松套种杨梅模式(7.41 t·hm^-2·a^-1)>马尾松套种油茶模式(5.89 t·hm^-2·a^-1)>马尾松套种无患子模式(5.86 t·hm^-2·a^-1)>马尾松套种黄栀子模式(4.95 t·hm^-2·a^-1)>马尾松纯林对照(2.45 t·hm^-2·a^-1)。马尾松套种杨梅和马尾松套种无患子模式的年净生态系统碳平衡分别为2.04和3.27 t C·hm^-2·a^-1,表现为“碳汇”,马尾松套种油茶和马尾松套种黄栀子模式及马尾松纯林对照的年净生态系统碳平衡分别为-1.80、-0.80和-0.45 t C·hm^-2·a^-1,表现为“碳源”。总体上,短期内马尾松低效林套种杨梅或无患子能够提升林分的固碳增汇效益。     

江西省油茶综合生产潜力与资源利用效率评估

江西适合油茶生长,但开发利用程度不高,分析评估其生产潜力与资源利用效率,可为进一步优化油茶种植分区、提高产量、合理利用国土资源等提供依据。以江西省油茶综合生产潜力为研究对象,基于潜力衰减法逐级修订得到自然生产潜力,结合社会有效系数得到综合生产潜力,并进行资源利用效率评估。结果表明: 1)江西省油茶各级生产潜力平均值在10229～17724 kg·km^-2,从赣南向赣西北递减,平均综合生产潜力为12550 kg·km^-2,分级后具有较高潜力和高潜力类可利用土地面积达51656 km²,占全省面积的31.1%;市级生产潜力中,赣州最高。2)江西省油茶生产潜力变幅为2223～3857 kg·km^-2,各级潜力变化量的区域差异较小;油茶资源满足率为69.3%～122.7%,各级资源满足率区域差异较小;油茶资源组合利用效率为49.1%～85%,各级生产潜力利用率的区域差异较大。3)综合生产潜力评估结果与江西油茶实际产量较符合,资源利用效率评估结果与江西自然和社会条件相符,可以作为相关研究与政策制定的参考。     

油茶栽培历史与长江流域油茶遗传资源

普通油茶(Camellia oleifera)是我国第一大木本油料作物。普通油茶作为油料作物的栽培历史, 现存确切记载不到1,000年, 长江流域可能是最早栽培油茶的地区之一。普通油茶的野生近缘种是油茶育种宝贵的遗传资源。普通油茶属于山茶科山茶属(Camellia)油茶组(Sect. Oleifera), 其野生近缘种应包括山茶属油茶组和短柱茶组(Sect. Paracamellia)的物种, 但油茶组和短柱茶组的划分仍有争议, 物种间的系统发育关系仍不清楚。油茶组和短柱茶组是山茶属中多倍体出现频率最高的类群, 而且存在突出的种内多倍性现象, 人工选择和种间杂交可能在其中起到促进作用。长江流域是普通油茶的主产区, 也是最主要的野生普通油茶分布区, 拥有丰富的野生普通油茶遗传资源。本研究统计了山茶属油茶组和短柱茶组物种的分布地, 并与野生普通油茶的潜在分布区进行了比较。分析结果显示, 长江流域与珠江流域的分水岭——南岭、苗岭及附近地区是油茶组和短柱茶组物种多样性最高的地区, 同时也是野生普通油茶潜在的高适生区, 可能是普通油茶及其野生近缘种潜在的种间杂交带。物种多样性从南向北呈下降趋势, 可能反映了从南向北的扩散方向。普通油茶及其野生近缘种间的潜在杂交带可能蕴含着丰富的遗传多样性, 为选择育种提供了天然的育种场, 应对这些地区优先开展研究和保护, 挖掘与利用有重要经济价值的遗传资源。     

澳洲坚果MibZIP1基因克隆及表达规律分析

为研究澳洲坚果（Macadamia integrifolia）中bZIP转录因子家族成员在逆境抗性中潜在功能,从‘桂热1号’品种果实中克隆MibZIP1基因。结合转录因子结构分析和不同处理下表达规律进行分析发现MibZIP1基因序列长度1 157 bp,基因编码区长度927 bp,编码308个氨基酸。MibZIP1存在典型bZIP superfamily结构域。系统进化分析鉴定出澳洲坚果MibZIP1、蒂罗花（Telopea speciosissima）TsbZIP60和荷花（Nelumbo nucifera）NnbZIP60亲缘关系较近。组织表达分析结果表明MibZIP1在‘桂热1号’品种叶片中的表达量最低,在‘695’品种枝条中的表达量最高。其在受玉米素、水杨酸、乙烯利和脱落酸处理的“桂热1号”叶片中显著上调表达,在赤霉素和过氧化氢处理的“桂热1号”叶片中表达差异不显著。推测MibZIP1与澳洲坚果抗逆性有关,为研发澳洲坚果新型栽培和激素调控技术提供理论指导。