人CCAAT增强子结合蛋白β抑制骨肉瘤细胞增殖

目的:构建带Myc标签的CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)的真核表达载体,并检测其对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:应用PCR技术从人乳腺文库中扩增C/EBPβ全长编码区基因,并克隆到pXJ-40载体中;将重组质粒转染人胚胎肾293T细胞,采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定蛋白表达;另将重组C/EBPβ质粒转染入骨肉瘤细胞系U20S,生长实验检测其对肿瘤细胞增殖的影响。结果:基因测序和双酶切鉴定表明,Myc-C/EBPβ真核表达质粒构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果显示,Myc-C/EBPβ转染人胚胎肾293T细胞后获得表达;生长实验证明C/EBPβ具有抑制骨肉瘤细胞增殖的功能。结论:构建了Myc-C/EBPβ的真核表达载体,为全面了解C/EBPβ的生物学功能及调控机理奠定了基础。     

乙酰肝素酶促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭的体外研究

目的:探讨通过基因转染正向调节HPSE-1,体外对骨肉瘤细胞系恶性特质的影响.方法:转染HPSE-1基因至骨肉瘤细胞系MG-63,检测HPSE-1 mRNA和蛋白水平的表达,进一步应用MTT试验和Transwell侵袭试验观察稳定转染的细胞的增殖力和侵袭力的影响.结果:成功建立稳定转染HPSE-1基因的MG-63细胞系MG-63-HPSE,且该细胞系在mRNA和蛋白水平均发现HPSE-1表达增高,MTT和Transwell试验结果发现MG-63-HPSE细胞的增殖力和侵袭力均明显高于对照组.结论:基因转染后过表达HPSE-1的骨肉瘤细胞系体外表现出增强的增殖和侵袭活性.     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

NALP1 基因与骨肉瘤细胞的相关研究

目的:探讨NALP1基因在骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的表达,以及高表达NALP1基因对于骨肉瘤细胞体外凋亡的影响。方法:使用RT-PCR、Western-blot法检测骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平并与人成骨细胞株hFOB1.19比较。将NALP1基因转染质粒PcDNA3.1,将重组质粒转染骨肉瘤细胞,分成高表达基因组、空质粒组及对照组,加入抗肿瘤药物顺铂及甲氨蝶呤促使肿瘤细胞凋亡,使用流式细胞仪测定各组肿瘤细胞凋亡率。结果:通过统计分析,骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平均低于人成骨细胞株hFOB1.19(P<0.05),NALP1高表达组的肿瘤细胞凋亡率明显高于空白质粒组及对照组。结论:上调骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的NALP1的表达量可以促进肿瘤细胞凋亡。     

人线粒体转录终止因子3基因RNA干扰表达载体的构建筛选与干扰效果评价

目的:构建人线粒体转录终止因子3(MTERF3)基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达载体,并在mRNA和蛋白质水平对其干扰效率进行验证,以检测和筛选出干扰效率最优的shRNA表达载体。方法:根据人MTERF3基因全长cDNA序列,利用Oligoengine在线软件设计4个shRNA序列,合成4条互补寡核苷酸链,退火成双链后克隆至psiU6.1载体,得到4个重组干扰质粒psi-MTERF3-1～psi-MTERF3-4,并通过PCR和DNA测序对其进行鉴定;将重组干扰质粒利用脂质体介导瞬时转染He La细胞,转染48 h后采用real time RT-PCR检测4个干扰质粒对MTERF3 mRNA表达水平的影响,采用Western印迹检测其对MTERF3蛋白表达水平的情况,并筛选出最有效的shRNA干扰质粒。结果:PCR鉴定和DNA测序鉴定证实重组质粒中已插入目的DNA序列;real time RT-PCR和Western印迹结果表明4个重组载体均可以显著降低人MTERF3基因mRNA和蛋白质的表达水平(P0.05),其中以pSi-MTERF3-4的干扰效率最优,对MTERF3 mRNA表达的抑制率为70.1%,对MTERF3蛋白表达的抑制率为72.2%。结论:在人宫颈癌He La细胞系筛选出有效干扰MTERF3基因表达的shRNA序列,构建了针对MTERF3基因的RNA干扰真核表达载体且能够有效抑制目的基因的表达,为进一步研究人MTERF3在宫颈癌发生发展中的作用机制提供了实验基础。     

靶向白介素-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系的构建

目的：构建针对IL-1α基因的shRNA表达载体,筛选能够抑制Hela229细胞内源性IL-1α表达的shRNA,建立无内源性IL-1d表达的Hela229稳定细胞系.方法：根据shRNA的设计原则,以IL-1 αcDNA oligo为模板设计一段21 bp核苷酸目标序列,构建成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制IL-1α基因的重组shRNA质粒,转染Hela229细胞,经G418筛选后获得单克隆稳定细胞株,用ELISA方法在蛋白水平上检测IL-1α基因的沉默效果.结果：经酶切鉴定和测序分析确定IL-1 α-shRNA重组质粒构建正确,ELISA筛选出能够显著抑制内源性IL-1α表达的shRNA,获得沉默内源性IL-1 α表达的单克隆稳定的Hela229细胞株.结论：靶向IL-1α基因的重组shRNA表达质粒可显著抑制Hela229细胞内源性IL-1α的表达,成功构建靶向IL-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系.     

miRNA-194 对人骨肉瘤细胞系SOSP-9607 转移的作用研究

目的:通过建立表达不同高低水平miRNA-194的骨肉瘤细胞系,研究和探测miRNA-194对于骨肉瘤细胞转移特性的影响和作用。为进一步研究miRNA-194作为生物治疗的新靶点提供理论依据。方法:使用慢病毒技术,对骨肉瘤细胞进行转染和筛选,获得表达不同高低水平miRNA-194的骨肉瘤细胞系并进行分组。通过Transwell实验,划痕实验对miRNA-194在骨肉瘤中的作用进行探索。结果:1)慢病毒转染及筛选成功,获得表达不同高低水平miRNA-194的骨肉瘤细胞系;2)transwell迁移及侵袭实验中,miRNA-194过表达组的迁移(28.60±4.36)及侵袭(21.25±6.42)能力都显著的小于其余各组,相应的,miRNA-194沉默表达组(132.60±15.64;115.76±11.38)则高于其余各组。划痕实验结果显示,miRNA能够显著的抑制骨肉瘤细胞SOSP-9607的划痕愈合能力(P0.01)。结论:miR-194能够对骨肉瘤细胞SOSP-9607的转移起到明确的抑制作用。MiRNA-194有望成为骨肉瘤转移与治疗的新靶点。     

慢病毒介导的靶向c-Met可诱导shRNA稳定乳腺癌MDA-MB-231细胞系的构建及生物活性鉴定

目的:探讨适当敲除c-Met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-Met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western印迹检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-Met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-Met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-Met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-Met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-Met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。     

带Myc标签的人B55α真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:构建带有Myc标签的人B55α真核表达载体,获得Myc-B55α融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出B55α编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体,Western印迹检测其表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测B55α蛋白表达水平及其对AKT磷酸化的影响;免疫共沉淀实验检测B55α与AKT是否存在相互作用。结果:双酶切和测序结果表明Myc-B55α真核表达质粒构建成功;Western印迹证实转染293T细胞后Myc-B55α融合蛋白获得表达,并可抑制AKT308的磷酸化;免疫共沉淀结果表明B55α与AKT存在相互作用。结论:构建了带Myc标签的人B55α真核表达载体,为进一步研究B55α在蛋白磷酸化修饰功能中的作用奠定了基础。     

CRISPR/Cas9技术介导的稳定沉默LDHA表达对肺癌A549细胞增殖的影响

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定沉默乳酸脱氢酶A(LDHA)的A549细胞系,并探讨LDHA沉默对细胞增殖能力的影响。方法:构建特异性靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA,转染A549细胞后经嘌呤霉素筛选获得LDHA沉默的稳定细胞株,并用定量PCR和免疫印迹实验分别检测LDHA m RNA和蛋白的沉默效率。利用MTT法检测A549细胞的增殖情况。结果:测序结果证实,CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA构建成功;筛选出LDHA沉默A549细胞株,定量PCR和免疫印迹实验证实LDHA m RNA和蛋白的表达量均明显下调。MTT法证实:培养24,48,72h后,LDHA沉默A549细胞与对照细胞相比,其增殖被抑制。结论:转染靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体,可明显下调LDHA m RNA和蛋白表达,抑制肺癌细胞A549的增殖。     

人CD46 RNAi 逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

目的:构建并筛选携带针对CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,从而特异、有效地抑制人CD46mRNA水平。方法:利用DNA重组技术,将2条60nt能转录产生靶向CD46小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,并转化大肠杆菌JM109。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确。结论:特异性沉默CD46基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体构建成功,为后续转染Jurkat细胞,研究CD46在T细胞的信号转导中的作用奠定了基础,对进一步研究T细胞相关疾病及开展细胞免疫缺陷的治疗方面提供了新的思路与方向。     

稳定干扰核糖体蛋白RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株的建立

目的建立稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株。方法设计并合成靶向人RPS7基因的shRNA寡核苷酸片段,克隆到逆转录病毒载体pSIREN中,构建重组质粒pSIREN-RPS7-shRNA,转染293T细胞,将包装产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌HeLa细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆,用real-timePCR和Western印迹检测细胞中RPS7mRNA和蛋白表达水平。结果获得了经测序鉴定正确的重组逆转录病毒质粒,逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出的稳定细胞中,RPS7mRNA和蛋白水平均显著低于干扰对照细胞。结论成功构建了靶向人RPS7基因的shRNA逆转录病毒载体,建立了稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株．为进一步研究RPS7在宫颈癌中的生物学功能和作用机制提供了可靠的细胞模型。     

小鼠Dppa2基因shRNA载体的构建及干扰效果的检测

目的:构建有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体。方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建pSUPER.Retro.puro干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证。进一步将各干扰载体分别转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),RT-PCR检测干扰效率。结果:PCR,酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各重组载体分别转染小鼠ESCs发现,干扰组Dppa2基因表达水平相对于空载体对照组和阴性shRNA载体对照组明显下调。结论:成功构建了有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA干扰载体,为进一步研究Dppa2基因在维持小鼠ESCs不分化过程中的作用提供了基础。     

RNAi沉默STAT3基因对人大细胞肺癌细胞增殖的影响

旨在研究RNAi沉默STAT3基因对人大细胞肺癌NCI-H460细胞增殖的影响。针对STAT3基因mRNA设计合成5条短发夹DNA,构建重组SiRNA-ST3质粒(命名为SiRNA-ST3-1,2,3,4,N)。用重组质粒分别转染NCI-H460细胞,RT-PCR法检测转染24 h后STAT3 mRNA的表达;Western blotting法检测转染24 h和48 h后STAT3、pSTAT3蛋白表达;MTT法检测转染24 h、48 h、72 h后NCI-H460细胞增殖情况。结果显示,SiRNA-ST3载体构建成功。RT-PCR和Western blotting检测结果表明,NCI-H460细胞转染重组质粒SiRNA-ST3-2和SiRNA-ST3-3后STAT3基因mRNA转录和STAT3、pSTAT3蛋白表达都明显下降(P<0.05)。与未转染组比,SiRNA-ST3-2组和SiRNA-ST3-3组NCI-H460增殖能力24 h、48 h降低明显(P<0.05);与SiRNA-ST3-N组比,SiRNA-ST3-2组和SiRNA-ST3-3组NCI-H460增殖能力48 h降低明显(P<0.05)。由此证实,构建的重组质粒SiRNA-ST3-2、SiRNA-ST3-3能有效靶向沉默STAT3基因,并抑制人大细胞肺癌NCI-H460细胞的增殖能力。     

HSP27 特异性shRNA 表达载体的构建及在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株 SW1990/Gem 中的表达

目的:构建HSP27基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体及观察其在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem中的表达,为进一步探索肿瘤的基因治疗打下前期基础。方法:参考文献及shRNA设计原则,设计并合成2条能转录shRNA的DNA序列,退火连接后,插入含绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNAT-shHSP27。重组载体经鉴定后转染SW1990/Gem,倒置荧光显微镜观察转染情况,RT-PCR、Western Blot从mRNA及蛋白水平探讨转染对耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem的影响。结果:成功构建了针对HSP27基因的shRNA表达载体。倒置荧光显微镜下显示转染48h后SW1990/Gem细胞内存在GFP表达。RT-PCR、WesternBlot结果提示转染后HSP27的mRNA及蛋白表达水平较对照组有明显抑制(P<0.05)。结论:成功构建针对HSP27基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制HSP27表达,为进一步研究HSP27与胰腺癌生物学行为及化疗耐药等相关性奠定了基础。     

Silencing of HMGA1 expression by RNA interference suppresses growth of osteogenic sarcoma

The expression of high mobility group protein A1 (HMGA1) protein has been closely related to various malignant and prognostic degrees of tumor. To investigate the influence of down-regulating HMGA1 on the tumor and the mechanism underlying antitumor of HMGA1, we transfected the HMGA1 shRNA vector into the osteogenic sarcoma MG-63 cell and observed the changes of cell proliferation, invasion abilities, and the tumor growth. HMGA1 gene expression could be efficiently inhibited, and cell proliferation, migration, invasion, and matrix metalloprotease level were also decreased. BALB/C nude mice injected with the MG-63 cells transfected HMGA1 shRNA showed the significant lower tumor weight, tumor volume, and longer tumor-forming time compared with the control group. Our results suggest that knockdown of HMGA1 could inhibit growth and metastasis potentials of MG-63 cells, which may be a therapeutic target protein for osteogenic sarcoma and may be of biological importance.     

miR-15a 和miR-16-1 模拟物对人骨肉瘤细胞系SOSP-9607 凋亡 和增殖的影响

目的:探讨miR-15a和miR-16-1模拟物对于人骨肉瘤细胞系SOSP-9607凋亡和增殖的影响。方法:将SOSP-9607细胞分为实验组和对照组。实验组分为miR-15a组、miR-16-1组、miR-15a+miR-16-1组。以miR-15a组为例,采用miR-15a模拟物(hsa-miR-15a mimics)上调SOSP-9607细胞内的miR-15a表达量。对照组分为阴性对照组和空白对照组。采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,并计算细胞增殖效率。结果:通过统计学分析,实验组凋亡率与阴性对照组凋亡率相比明显增高(P<0.05);实验组的细胞增殖率明显低于对照组(P<0.05)。结论:上调SOSP-9607细胞内miR-15a和miR-16-1的表达量可促进SOSP-9607细胞的凋亡并抑制其增殖。     

Txnip基因siRNA慢病毒表达质粒构建及促进猪前体脂肪细胞分化

硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein, Txnip)是一种氧化还原调节蛋白质,与硫氧还蛋白结合并抑制其活性,调节细胞氧化还原状态,影响细胞多种生理过程,然而其在猪脂肪细胞分化中的作用尚不明确。本文设计合成3对靶向猪Txnip基因的shRNA寡核苷酸,分别连接于重组慢病毒载体pGLV_3/H_1/GFP+Puro构建siRNA表达质粒。测序验证后,与包装质粒共转染293T细胞,获得滴度1×10~8 pfu/mL的慢病毒干扰质粒。以MOI值100转染原代培养猪前体脂肪细胞,转染率均达80%以上,其中Txnip-shRNA-2转染细胞Txnip基因沉默率达75%。转染Txnip-shRNA-2的猪前体脂肪细胞用成脂分化培养液诱导后,每隔1 d检测细胞成脂分化及相关基因表达。结果发现,其分化比阴性对照质粒转染或未转染细胞显著增强(P<0.05),PPARγ和FAS mRNA表达水平显著提高(P<0.05)。本文构建siRNA慢病毒表达质粒能有效干扰猪Txnip基因表达,Txnip表达沉默可通过上调PPARγ表达促进猪前体脂肪细胞分化。本研究提示,Txnip可能是猪脂肪细胞分化的抑制因子。