纽蛋白在原代培养脊髓神经元的分布及其与神经元形态的相关性

目的　用免疫组织化学及形态学等方法对原代培养大鼠脊髓神经元的形态及其纽蛋白 (vinculin)分布进行研究。方法　实验采用原代培养的大鼠脊髓神经元 ,用细胞松弛素 D(cytochalasin D) -丝状肌动蛋白解聚剂处理细胞后 ,用相差显微镜观察细胞形态 ,同时用单克隆抗体免疫组化方法显示细胞内纽蛋白的分布。结果　原代培养的脊髓神经元可见 2～4个细长的突起 ;免疫组织化学方法显示纽蛋白在神经元的胞体及突起均有分布。细胞松弛素 D处理细胞后 ,神经元胞体变大 ,轮廊不清 ,突起增多 ,变短、变粗 ,多分支且分支末端膨大 ;免疫组织化学方法显示纽蛋白在核周的分布明显增加 ,而在突起内的分布则变得不连续 ,呈散在点状。结论　丝状肌动蛋白 (filem ental- actin,F- actin)的完整性对维持神经元的正常形态是必需的 ;神经元形态的变化与纽蛋白分布的变化相关     

原代培养脊髓神经元线状溶酶体与细胞骨架蛋白-纽蛋白关系的研究

目的研究原代培养脊髓神经元线状溶酶体(nematolysosome)的形成与分布及其与细胞骨架蛋白-纽蛋白(vinculin)的关系.方法用细胞松弛素D(cytochalasin D,CD)及佛波醇酯(phorbol myristate acetate,PMA)处理原代培养脊髓神经元,用免疫荧光双标记纽蛋白及组织蛋白酶D(cathepsin D)、酸性磷酸酶(ACPase)、电镜细胞化学及共焦激光扫描显微镜方法研究线状溶酶体与纽蛋白的关系.结果在正常对照组神经元,组织蛋白酶D(标记溶酶体)与纽蛋白分布于胞质及突起内;在CD及PMA处理神经元,纽蛋白及组织蛋白酶D的分布呈向心性移动,但集聚的部位不同;电镜酶细胞化学方法显示CD组及PMA组神经元内线状溶酶体均增多.结论组织蛋白酶D及纽蛋白在培养脊髓神经元内协同分布,CD及PMA均可引起二者分布的变化,提示纽蛋白可通过增强细胞内吞体/溶酶体系统活动而使线状溶酶体增加,也可通过促进丝状肌动蛋白聚合而影响线状溶酶体的形成及运动.     

肌动蛋白与纽蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达

目的研究新生大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中肌动蛋白(actin)的时空表达变化及其与纽蛋白(vinculin)的关系.方法采用神经干细胞培养、免疫细胞化学技术对神经干细胞定向分化为神经元的过程中actin的时空表达进行研究;采用免疫荧光双标术及共聚焦激光扫描显微术对定向分化神经元过程中,actin与vinculin关系进行探讨.结果在神经干细胞向神经元定向分化过程中, actin在胞体与突起中有表达,且与日渐增,核周表达逐渐增强,分化成熟时胞体与突起中可见丝状细胞骨架随着突起伸展而延伸.免疫荧光双标actin、vinculin在CLSM下观察,分化早期,胞体和突起内均有分布,actin明显强于vinculin,而vinculin于核周及一侧突起较强.分化近成熟期,vinculin反应增强,随着细胞突起生长,在突起中两蛋白共存处可见节段状分布的黄色融合光,直达突起的末端.结论本研究揭示在大脑皮层神经干细胞定向分化为神经元过程中,actin表达变化与神经元发育成熟呈正相关,且actin与vinculin共存.     

纽蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达及其与辅肌动蛋白的关系

目的探讨纽蛋白(vinculin)在新生大鼠大脑皮层神经干细胞定向分化神经元过程中的表达变化及其与辅肌动蛋白(α-actinin)的关系.方法将神经干细胞分离、培养、分化及鉴定后,采用免疫组化技术对新生大鼠皮层神经干细胞向神经元定向分化过程中,纽蛋白的时空表达进行研究,并采用免疫荧光双标技术及共聚焦激光扫描显微术对神经元定向分化过程中,纽蛋白与辅肌动蛋白关系进行探讨,利用图像分析技术对不同时段分化的神经元中vinculin平均积分光密度进行定量测定.结果在神经干细胞定向分化为神经元的过程中,vinculin由核周淡染分布逐渐至在胞体与突起中密集均匀分布,随着突起伸展而不断地延伸.图像分析结果表示,随神经元的分化成熟,vinculin的表达量呈逐渐增加趋势.在共聚焦激光扫描显微镜下观察免疫荧光双标vinculin/α-actinin在分化早期胞体和突起内均有分布,可见核周和突起两者融合两蛋白共存.近成熟期,随突起生长,两蛋白渐伸入突起,直至末端共存.结论本研究揭示大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中,vinculin表达变化与神经元发育成熟呈正相关,并且vinculin与α-actinin共存.     

大鼠脊髓匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:观察大鼠脊髓匀浆上清诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)形成的神经元样细胞形态特征.方法:通过贴壁法培养分离大鼠骨髓MSCs,体外扩增纯化后加入正常大鼠脊髓匀浆上清诱导72h,倒置显微镜下观察诱导前后细胞的形态结构.激光共聚焦显微镜观测钙离子细胞形态和荧光强度变化,免疫细胞化学方法鉴定诱导后细胞的表型特征.结果:倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,核居中,有1-2个核仁,诱导后细胞呈神经元样,细胞伸出较长的轴突样和树突样突起.免疫细胞化学法显示NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NF(神经丝蛋白)阳性,GFAP(神经胶质细胞酸性蛋白)阴性.共聚焦显微镜扫描脊髓匀浆上清诱导前细胞形态呈细长的梭形,细胞核不明显,胞体染色强,突起染色弱,荧光像素值低;诱导后,细胞呈现神经元样形态,胞体大,有多个突起,胞体及各突起染色强,荧光像素值高.结论:大鼠脊髓匀浆上清液可在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞.     

脊髓神经元中微管相关蛋白—5的分布及可塑性

用新生Wistar大鼠进行脊髓神经元培养,研究微管相关蛋白-5与其单克隆抗体结合后的分布情况,使用微管解聚药nocodazole处理神经元,应用免疫组织化学染色来观察微管相关蛋白-5的改变,另一组神经元使用nocodazole处理后再用PMA处理,观察微管相关蛋白-5及神经元的改变。结果表明,微管相关蛋白-5在胞浆及突起中均有分布,并随着培养天数的递增而递减。使用nocodazole后神经元中微管相关蛋白-5的分布及数量明显减少。PMA处理神经元后尽管使微管相关蛋白-5的正常结构被破坏,而神经元的伸展却不受影响。     

亨廷顿蛋白相关蛋白1在成年大鼠脊髓中的分布

目的观察亨廷顿蛋白相关蛋白1(huntingtin-associated protein 1, HAP1)在成年大鼠脊髓中的分布特点.方法采用免疫组织化学ABC法和免疫印迹(Western blotting)方法.结果免疫组织化学结果显示,在成年大鼠脊髓中,以背角灰质浅层(Rexed Ⅰ,Ⅱ层)的HAP1免疫反应性最强,阳性细胞最密集,免疫反应产物除分布在胞体外,还大量弥散分布于胞体间的神经毡内;背角深层有部分HAP1免疫反应阳性细胞呈散在分布,中央管周围灰质(Rexed X)内阳性胞体密度和免疫反应性强度仅次于后角浅层,而在脊髓腹角,偶见HAP1免疫反应阳性神经元.此外, Western blotting分析显示,脊髓背角内HAP1表达水平明显高于脊髓前角.结论 HAP1主要分布于大鼠脊髓背角灰质浅层和中央管周围灰质神经元内,提示其可能与痛觉信息一级传入和/或调控有关.     

脊髓培养神经元中微管相关蛋白-5的分布及可塑性

用新生 Wistar大鼠进行脊髓神经元培养 ,研究微管相关蛋白 - 5与其单克隆抗体结合后的分布情况。使用微管解聚药 nocodazole处理神经元 ,应用免疫组织化学染色来观察微管相关蛋白 - 5的改变。另一组神经元使用 nocodazole处理后再用 PMA处理 ,观察微管相关蛋白 - 5及神经元的改变。结果表明 ,微管相关蛋白 - 5在胞浆及突起中均有分布 ,并随着培养天数的递增而递减。使用 nocodazole后神经元中微管相关蛋白 - 5的分布及数量明显减少。PMA处理神经元后尽管使微管相关蛋白 - 5的正常结构被破坏 ,而神经元的伸展却不受影响     

脊髓和脊神经节原代分离培养中GABA能神经元的形态观察

选用12—14天胚胎小鼠(C 57 BL/6J),取脊髓及脊神经节原代培养。观察神经元的发育并用GABA抗血清、PAP方法显示GABA能神经元。脊髓神经元呈各种形态大小,随着培养的进行它们的突起和胞体不断生长;脊神经节细胞有不同大小,其体积在培养中保持恒定。随着神经元的逐渐成熟,它们的核质比不断增大。GABA免疫细胞化学阳性脊髓神经元大小不等,可分为两类:1.突起和胞体阳性,核不着色而核仁着色;2.只在突起和细胞膜上有阳性反应而胞体及核为阴性(可能为GABA摄取的结果)。有不同大小的脊神经节细胞呈阳性反应,其胞体及核仁着色而核呈阴性反应。证实了培养条件下处于胚胎发育阶段的阳性脊神经节细胞的存在。     

脊髓和脊神经节原代分离培养中GABA能神经元的形态观察

选用１２－１４天胚胎小鼠（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）,取脊髓及脊神经节原代培养。观察神经元的发育并用ＧＡＢＡ抗血清、ＰＡＰ方法显示ＧＡＢＡ能神经元。脊髓神经元呈各种形态大小,随着培养的进行它们的起和胞体不断生长;脊神经细胞有不同大小,其体积在培养中保持恒定。随着神经元的逐渐成熟,它们的核质比不断增大。ＧＡＢＡ免疫细胞化学阳性脊髓神经元大小不等,可分为两类：１．突起和胞体阳性,核不着色而核仁着色;２．只在突     

红藻氨酸诱导原代培养皮质神经元兴奋毒中p21变化及机制的研究

目的：探讨p21在红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元兴奋毒中的变化及可能机制。方法：原代培养大鼠皮质神经元经红藻氨酸（KA）处理24h后,激光共聚焦显微镜透射光下观察细胞损伤,应用Western blotting方法检测p21与p53蛋白表达的变化,用染色质免疫共沉淀（ChIP）-聚合酶链反应（PCR）方法检测p53与p21基因启动子上p53反应元件1结合情况。结果：KA处理后神经元明显损伤,部分细胞胞体缩小、变圆,突起变短、减少或消失,p21与p53蛋白表达上调,并且p53与p21基因启动子上的p53反应元件1结合增加。结论：在KA诱导的原代培养皮质神经元兴奋毒作用中p21蛋白表达上调,而p53直接参与了p21的激活。     

中国组织化学与细胞化学杂志第11卷(2002年)第1期-第4期总目次

周围神经 43ｋＤ蛋白免疫化学研究顾晓松等 (1)…………纽蛋白在原代培养脊髓神经元的分布及其与神经元形态的相关性荣　明等 (4)……………………马桑内酯慢性致痛大鼠海马星形胶质细胞的激活赵珠峰 (8)………………………………………………ｃ ｅｒｂＢ 2单克隆抗体Ａ18在乳腺癌中表达特性的研究吴　强等 (14)……………………………细胞间粘附分子 1在人皮肤血管瘤的表达伍静文等 (2 0 )…………………………………………慢性捆绑紧张致大鼠记忆受损及海马神经元ＮＯＳ和Ｔａｕ5的变化———组织化学与免疫组织化学研究李宏莲等 (2 4)……     

两种亨廷顿蛋白相关蛋白1异构体—HAP1A和HAP1B在大鼠脊髓灰质内的分布特征

目的明确2种亨廷顿蛋白相关蛋白1(huntingtin-associated protein 1,HAP1)异构体—HAP1A和HAP1B在大鼠脊髓灰质内的分布特征。方法提取重组表达的谷胱甘肽S-转移酶(GST)-HAP1AC末端融合蛋白和GST-HAP1BC末端融合蛋白,免疫兔和豚鼠制备分别抗HAP1A和HAP1B特异性多克隆抗体,并采用免疫印迹技术对其特异性和效价进行鉴定和检测;用免疫组织化学技术检测HAP1A和HAP1B在大鼠脊髓灰质内的分布和定位特征。结果成功制备了分别特异性识别HAP1A和HAP1B的高效价多克隆抗体,应用这些抗体进行的免疫组织化学ABC法检测显示,HAP1A与HAP1B在大鼠脊髓灰质内的分布区域相似,二者均在大鼠脊髓灰质RexedⅠ-Ⅹ层表达,在RexedⅠ、Ⅱ层表达最强,中央管周围灰质(RexedX层)其次,在RexedⅢ-Ⅵ层表达水平较低,在脊髓前角(RexedⅦ-Ⅸ层)只有极微弱的或无阳性表达。HAP1A免疫反应产物主要定位在Stigmoid小体,在神经元胞质和近端突起内只有极少的弥散反应产物;HAP1B免疫反应性较强,其免疫反应产物弥散、均匀分布在神经元核周质和近端突起内,也定位在Stigmoid小体上。免疫荧光双重标记显示,约有80%的Stigmoid小体既表达HAP1A也表达HAP1B,其余的Stigmoid小体仅表达HAP1A。结论 HAP1A和HAP1B蛋白在大鼠脊髓灰质内具有相同的区域分布模式,但在神经元内的定位具有明显区别,提示二者可能具有不同的功能。     

人脊髓创伤后神经元病变的神经丝免疫组织化学研究

本文用神经丝（ＮＦ）免疫组织化学方法在１５例人体尸检材料中研究了脊髓创伤后生存２ｈ～９Ｗ的脊髓神经元胞体和轴突的病理学改变。结果表明：脊髓创伤后２ｈ,神经丝免疫组织化学反应即可显示ＮＦ阳性反应产物在轴突内聚集。创伤后第４天,病变的前角运动神经元胞体内神经丝反应异常地增强。以上结果表明：神经丝免疫组织化学方法比常规显示轴突的染色方法能更早更清晰地显示脊髓内轴突的病变,并进一步证实了创伤后细胞骨架紊乱在神经元的病理发病机理中起重要作用。     

SD大鼠乳鼠皮层神经元细胞原代培养模型的建立及鉴定

摘要 目的：探讨SD大鼠乳鼠皮层神经元细胞原代培养方法,并鉴定其培养效果,以期建立一种生物学功能良好的体外细胞实验模型。方法：取出生24 h的SD大鼠乳鼠,分离出大脑皮层,在胰酶消化之前先进行离心,然后将胰酶消化后多次离心得到的细胞悬液接种于L-多聚赖氨酸包被的培养皿和共聚焦皿中,以加B27的Neurobasal-A培养基进行神经元细胞的原代培养,倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态;通过免疫荧光组化的方法采用神经元标记物MAP-2进行神经元纯度的鉴定;在导入Fluo4-AM的原代神经元细胞,观察电刺激后胞内钙离子信号的变化,以验证神经元细胞的生理状态。结果：采用此方法培养的神经元细胞紧密贴壁、分散均匀、状态良好,神经元细胞周围突起相互连接形成网络;经MAP-2免疫荧光组化技术鉴定神经元的纯度达到95%以上;胞内钙离子信号的变化提示所培养的神经元具有良好的生物学功能。结论：该方法能获得纯度较高并且生物学功能良好的原代培养的SD大鼠乳鼠皮层神经元细胞。     

回转器旋转对体外培养的鸡胚神经元的影响

用回转器旋转研究重力改变对体外培养的鸡胚神经元的影响。结果发现在回转器里经过７－９小时的处理后,神经元的形态和行为发生明显改变。只有６．３％的神经元呈现两极型的运动形态,而对照组正常培养的细胞运动形态的神经元占３４．２％。某些细胞的突起出现异常,呈现扭曲的形状。在培养基质上的神经元伸出许多丝状突起,丝状突起的末端锚定在周围的细胞上或锚定在培养基质上。经过重力改变处理的细胞重新放在相差显微镜下观察,结果显示神经元的运动活性降低,许多细胞没有观察到明显运动的迹象。     

RCS大鼠视网膜变性过程中二级神经元形态学变化的研究

用免疫组织化学方法研究RCS大鼠(Royal College of Surgeon's rat,RCS rat)视网膜变性过程中早、中、晚期二级神经元形态的变化。结果发现,P1MRCS大鼠各二级神经元未见明显的形态改变。P2M RCS大鼠视网膜外核层萎缩约85%,视杆双极细胞顶端树突萎缩;水平细胞的树突与轴突在外网状层的分层未见改变。P3M RCS大鼠视网膜外核层萎缩近95%,RCS大鼠视杆双极细胞顶端萌生新的神经突起;水平细胞的树突分支明显丢失,轴突在外网状层的分层发生改变,出现新生神经突起;无长突细胞的树突在内网状层的分层至变性晚期也未见改变。该研究表明RCS大鼠视网膜二级神经元形态的改变是继发性改变,是感光细胞变性后对传入缺失的一种反应,即重构反应。在进行视网膜功能救治时需要考虑重构反应带来的影响。     

高糖对海马神经元形态破坏和APP蛋白含量的影响

为探索高糖培养对原代海马神经元形态损伤和神经退行性相关蛋白β-淀粉样蛋白前体(amyloid β-protein precursor,APP)含量的影响,分离胎龄16 d的大鼠海马神经元,分别使用含有25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L和100 mmol/L葡萄糖浓度的Neurobasal培养基进行原代培养干预,Western-blot检测APP蛋白水平,光学显微镜下观察不同浓度葡萄糖作用后海马神经元形态的变化。结果发现:高糖培养后,胎鼠海马神经元突触变短,胞体肿胀,同时APP水平随着葡萄糖浓度的递增逐渐升高。以上信息提示高糖引发的神经元形态破坏与APP高水平有关,控制血糖可能有利于保护神经元细胞,使其免受损伤。     

大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中Tau蛋白表达的研究

目的探讨Tau蛋白在新生大鼠大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中的表达及意义.方法采用细胞培养、免疫细胞化学方法(SABC法)观察及计算机图像分析技术测定Tau蛋白在神经干细胞定向分化为神经元过程中不同时段的表达情况.结果在神经干细胞定向分化为神经元的过程中,Tau蛋白由核周淡染分布渐至在胞体与突起中密集均匀分布,随着突起伸展而不断地延伸,并且Tau蛋白的表达量逐渐增加.结论新生大鼠大脑皮质神经干细胞定向分化为神经元过程中,Tau蛋白的时空表达与神经干细胞定向分化的神经元形态变化有一定的相关性并在此过程中发挥着重要的作用.     

NO参与介导吗啡戒断大鼠脊髓神经元敏感化

运用Fos免疫组织化学、NADPH－d组织化学、F/NADPH－d双标、鞘内注射和反义寡核苷酸技术,观察吗啡戒断大鼠脊髓神经元活动变化及NO在其中的作用,结果发现：非吗啡依赖大鼠急性应用纳洛酮和吗啡依赖大鼠脊髓水平Fos-LI和NADPH－d阳性神经元表达与对照组相比无明显变化,二者也无Fos／NADPH－d双标神经元表达;吗啡依赖纳洛酮催促戒断大鼠脊髓Fos-LI、NADPH－d阳性神经元、纤维和终末表达明显增加,且出现Fos／NADPH－d双标神经元表达。Fos-LI和Fos／NADPH－d双标神经元呈现双侧脊髓全层分布,NADPH－d阳性神经元、纤维和终末主要位于双侧脊髓背角浅层。鞘内注射NOS抑制剂L－NA和nNOS反义寡核苷酸均明显降低吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断症状评分,减少吗啡戒断大鼠脊髓Fos-LI表达。上述结果提示：NO参与介导吗啡戒断大鼠脊髓神经元敏感化。