慢病毒介导的稳定表达LBH的前列腺癌细胞株的建立

目的:构建稳定表达LBH基因的人前列腺癌细胞株PC-3M-LBH,探讨LBH基因对PC-3M细胞增殖能力的影响。方法:构建表达LBH基因的重组慢病毒载体并制备出相应的慢病毒,感染低表达LBH基因的人前列腺癌PC-3M细胞后,经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆;实时荧光定量PCR和蛋白印迹法(Western-Blot)分别检测细胞株中LBH的mRNA、蛋白表达水平;采用CCK-8法检测表达LBH基因后细胞增殖能力的改变。结果:成功构建了重组慢病毒表达质粒p Lenti-LBH并包装出了慢病毒,感染前列腺癌细胞后经嘌呤霉素筛选得到PC-3M-LBH细胞株;PC-3M-LBH细胞株中LBH基因的mRNA和蛋白表达显著上调;相对母细胞和NC对照组,PC-3M-LBH细胞在接种后第4天即出现明显的生长抑制,到第6天其生长抑制率达到19.7%。结论:构建的细胞株能稳定表达LBH基因,该基因的表达能显著抑制前列腺癌PC-3M细胞的体外增殖。     

慢病毒介导稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株构建

[目的]通过慢病毒载体系统获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[方法]PCR扩增FRT-LacZ基因,亚克隆至慢病毒载体p LVX-PGK-Puro。经四质粒包装系统共转染293FT细胞包装重组慢病毒并检测病毒滴度,获得的慢病毒感染MDCK细胞,经嘌呤霉素筛选和β-半乳糖苷酶原位染色检测筛选鉴定转基因细胞株。[结果]测序证实,成功构建重组慢病毒质粒p LVX-FRT-LacZ-PGK-Puro。包装产生的慢病毒滴度为4.04×107TU/m L,重组慢病毒感染MDCK细胞后筛选获得稳定表达FRT-LacZ基因的MDCK细胞株。[结论]构建了稳定表达FRTLacZ基因的MDCK细胞株。     

HGF基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

目的:构建真核表达质粒p EGFP-N1-HGF并观察干细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在人皮肤成纤维中的表达。方法:从扩增人的间充质干细胞中提取全长RNA为模板,设计合成引物,用RT-PCR法扩增出HGF基因片段,然后将HGF基因片段连接于真核表达质粒p EGFP-N1中。双酶切鉴定及测序分析后,用脂质体包裹转染体外培养的人的皮肤成纤维细胞,通过荧光显微镜观察其转染效果,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HGF蛋白的表达。结果:经酶切鉴定及测序验证p EGFP-N1-HGF构建正确,经转染的人皮肤纤维细胞中观察到较强的绿色荧光并且可以表达一定量的HGF。结论:成功构建了真核表达质粒p EGFP-N1-HGF,为基因治疗脱发疾病提供实验基础。     

TurboFect介导骨形态发生蛋白2 转染CHO 细胞的研究

目的:构建真核表达载体p IRES-EGFP-BMP-2,通过Turbo Fect转染得到表达BMP-2蛋白的CHO细胞系。方法:利用逆转录PCR方法扩增获得人的BMP-2基因c DNA,克隆入p MD18-T载体,经PCR、酶切和基因测序分析等方法鉴定重组质粒;将BMP-2连入p IRES-EGFP真核表达载体中,经限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。以壳聚糖和Turbo Fect分别作为基因载体转染CHO细胞,荧光显微镜检测分析转染结果;G418筛选富集转染阳性细胞。结果:成功的克隆得到了BMP-2基因,酶切鉴定成功构建了p IRES-EGFP-BMP-2质粒。与壳聚糖组相比,Turbo Fect用量为1:1时,细胞阳性率为(31.92±1.31)%,高于壳聚糖的细胞阳性率(6.33±1.53)%。目的基因与Turbo Fect比例为1:2时转染效率为(42.90±1.10)%高于1:1的(28.59±2.38)%和1:3的(37.52±2.14)%。细胞密度调节到5×103 cells/cm2阳性细胞率可达到(44.43±3.23)%。荧光检测可见荧光阳性细胞得到稳定传代。Western Blot检测可见BMP-2蛋白表达。结论:Turbo Fect成功的介导了p IRES-EGFP-BMP-2载体转染CHO细胞,建立了稳定表达BMP-2和EGFP的CHO细胞株。     

稳定表达可视化hFcRn的MDCK细胞株构建

[目的]建立稳定表达融合EGFP的人新生儿Fc受体(h FcRn)的MDCK细胞株。[方法]构建重组慢病毒质粒p EGFP-h FcRn,采用四质粒包装系统共转染HEK 293T细胞生产重组慢病毒,感染MDCK细胞后对EGFP阳性细胞进行流式单细胞分选;通过Western Blot及EGFP-β2m荧光共定位验证h FcRn的完整性,并用流式细胞仪检测h FcRn与人Ig G的结合活性。[结果]测序结果表明成功构建p EGFP-FcRn慢病毒表达载体;感染后EGFP阳性MDCK细胞比例约为26.5%,流式单细胞分选后得到纯阳性细胞;荧光共定位及Western Blot均检测到h FcRn的完整表达;流式分析表明细胞株上的h FcRn与Ig G存在p H依赖性结合。[结论]成功获得稳定表达具有生物活性的可视化h FcRn的MDCK细胞株。     

慢病毒介导N2ICD过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株的构建及鉴定

[目的]构建慢病毒介导Notch2受体胞内段((Notch2 intracellular domain,N2ICD)过表达的人胃癌MKN45细胞稳定株并进行鉴定。[方法]采用PCR法扩增N2ICD基因并克隆至慢病毒载体PTYE-EF1α-IRES-EGFP(简写为pLV)中,通过酶切及测序鉴定后,三质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,收集且浓缩病毒毒液用于感染人胃癌MKN45细胞并筛选稳定细胞株,用Western Blot验证。[结果]成功构建慢病毒重组质粒N2ICD/pLV;包装病毒后,荧光显微镜下观察到大部分HEK293T细胞发出绿色荧光;收集病毒毒液感染MKN45细胞,显微镜下观察有部分细胞表达绿色荧光蛋白;流式分选技术筛选得到稳定细胞株,Western Blot鉴定结果显示:相比于空白对照组,稳定株的N2ICD过表达明显。[结论]成功构建慢病毒表达质粒N2ICD/pLV,并建立稳定过表达N2ICD的胃癌细胞株N2ICD/pLV-MKN45。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

共表达ETEC K99、GFP重组大肠杆菌的构建及表达北大核心

[目的]构建K99、GFP基因重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)感受细胞中表达。[方法]利用PCR扩增技术扩增K99基因和GFP基因,经连接和转化将目的片段克隆到pLA载体上,利用双酶切技术及PCR技术对重组质粒进行鉴定并测序分析,利用Western Blot技术分析蛋白质表达情况。[结果]测序分析结果表明,基因具有正确的阅读框;双酶切和PCR鉴定得到498 bp和720 bp的特异性条带;荧光检测表明重组菌表达了蛋白;Western Blot结果表明重组菌表达为融合蛋白。[结论]成功构建了大肠重组菌,并表达外源融合蛋白。     

人造血转录因子GATA-1的克隆、表达及其对间质细胞的生物学作用

目的:构建人GATA-1全长过表达载体,对其进行过表达,并初步探讨其在人非造血细胞(人脐静脉内皮细胞、人成纤维细胞)中的生物学作用。方法:以人脐带血cDNA为模板,采用高保真PCR获得GATA-1的CDS序列,连接至pGEM-T Easy载体,构建pBPLV-GATA1慢病毒表达质粒,并对上述载体进行NheⅠ、XbaⅠ双酶切和测序鉴定,鉴定正确后,在293T细胞中进行慢病毒包装,浓缩病毒后,对我们原代分离培养的人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞进行慢病毒感染,采用流式分选对阳性目的细胞进行纯化,阳性细胞扩增后进行Western印迹鉴定;以人包皮成纤维细胞(HFF)为研究对象,在光学及荧光显微镜下观察细胞形态变化情况,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞表面标志表达情况。结果:双酶切和测序结果表明克隆了1242 bp的人GATA-1全长CDS序列,经Western印迹检测,GATA-1在293T细胞中获得瞬时表达;获得了人GATA-1稳转细胞株,对稳转细胞株的检测表明,GATA-1对HFF细胞增殖具有一定的抑制作用,但对HFF细胞形态及细胞表面标志CD90、CD29的表达无明显影响。结论:构建了人GATA-1慢病毒表达载体及其稳转细胞株,GATA-1蛋白对间质细胞的增殖有一定的抑制作用。     

稳定表达重组小鼠FAPα蛋白细胞株的构建

采用RT-PCR方法从BALB/c胚鼠成纤维细胞克隆FAPα基因,将其连接至表达栽体pTd-FL-N,转化Stbl3感受态.筛选重组质粒,经酶切、PCR检测及测序鉴定,证实表达质粒构建正确.将表达载体转染HEK293细胞,经G418筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot技术证实稳定表达FAPα细胞株构建成功.通过流式细胞术确定FAPa蛋白可定位表达于细胞膜上.     

EEF1A2基因慢病毒表达载体的构建及慢病毒表达系统的建立

利用PCR方法合成EEF1A2的基因全长,经NotⅠ和NsiⅠ酶切后克隆到慢病毒载体pGLV5-EF1a-EGFP/Puro上。构建的重组质粒pGLV5/EEF1A2经PCR、酶切及测序鉴定正确后,利用慢病毒表达系统(pGLV5 Lentiviral Expression Systems),将重组质粒与包装系统质粒(pVSV-G,pGag/Pol,pRev)4质粒共转染293T细胞,收集培养上清并感染人胰腺癌SW1990细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株EEF1A2/SW1990。Real-time PCR和West-ern blot检测结果显示EEF1A2在EEF1A2/SW1990细胞中表达较原代细胞明显增高(P<0.05),MTT结果显示EEF1A2/SW1990细胞的增殖能力亦较原代细胞显著增强(P<0.05)。成功构建了EEF1A2基因的慢病毒载体质粒pGLV5-EEF1A2及其慢病毒表达系统,并筛选出稳定过表达EEF1A2的人胰腺癌细胞株EEF1A2/SW1990。     

p21RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的：构建抑制p21基因表达的pSUPERRNAi载体（pSUPER—p21）并鉴定其功能。方法：化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒（pSUPER-p21）。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达。结果：pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调。结论：靶向p21的pSUPERRNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达。     

Sp1真核表达载体的构建及对USP22基因转录活性的影响

目的 克隆人sp1基因,构建真核表细胞达载体pVAX-Sp1,研究其对USP22基因转录活性的影响.方法 Trizol试剂快速提取人肝癌细胞株HepG2总RNA,经RT-PCR扩增Sp1基因序列,与pVAX1真核表达载体连接;测序、酶切鉴定重组载体;pVAX1-Sp1与含USP22启动子的萤光素酶报告质粒共转染HepG2细胞,双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性表达.结果 测序及酶切结果显示重组质粒pVAX1-Sp1构建成功;高表达sp1可使USP22启动子的转录活性降低（P＜0.01）.结论 成功构建了sp1真核表达质粒,sp1对USP22启动子具有转录抑制作用.     

大鼠p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建大鼠p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)cDNA序列的绿色荧光真核表达载体并鉴定其在人胚肾293(human embryo kidney 293,HEK293)细胞中的表达.方法:采用PCR方法从含野生型大鼠p75NTR的pDC316-RP75质粒中扩增目的片段,经EcoRⅠ和SaⅡ双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达栽体pEGFP-N1-RP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及免疫组织化学法鉴定大鼠p75NTR的表达.结果:重组质粒经酶切鉴定和序列分析证实含有大鼠p75NTR的编码序列,转染后经激光共聚焦显微镜及免疫组织化学染色观察表明重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的大鼠p75NTR片段.结论:大鼠p75NTR绿色荧光真核表达栽体构建成功并可在HEK293细胞中表达,为进一步研究奠定了基础.     

携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。     

CEP55慢病毒表达载体构建和U251-CEP55细胞株的建立

目的:构建CEP55慢病毒表达载体,建立稳定表达CEP55的人脑胶质瘤U251细胞株。方法:使用PCR扩增方法将CEP55基因序列进行扩增,转入质粒中,并整合到载体上,构建重组质粒GV358-CEP55载体。与p Helper 1.0和p Helper 2.0质粒共转染293T细胞使其产生慢病毒,以GV358空载体包装的慢病毒作为对照。显微镜观察绿色荧光蛋白GFP表达强度,确定慢病毒的感染效率。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。慢病毒感染人胶质瘤细胞株U251后,经嘌呤霉素筛选出稳定表达CEP55基因的细胞株U251-CEP55。q RT-PCR和Western blot两种方法分别检测CEP55 m RNA及蛋白的表达。结果:测序证实慢病毒表达载体GV358-CEP55构建成功;转染293T细胞获得高滴度的病毒。病毒感染U251细胞后,使用嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株U251-CEP55;q RT-PCR和Western blot方法分别检测后发现,U251-CEP55细胞株中CEP55 m RNA和蛋白水平的表达明显高于对照组。结论:成功构建CEP55慢病毒表达载体,获得稳定表达CEP55的人胶质瘤U251细胞株,为CEP55基因功能的探究给予了一定的实验基础。     

人Nephrin—GFP融合蛋白真核表达载体的构建和鉴定

目的构建人19号染色体长臂Nephrin基因和绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）真核表达质粒,为进一步研究肾小球裂隙隔膜分子复合物构成与功能提供基础。方法设计引物,扩增真核表达质粒pEGFPN3中的GFP基因片段,将其插入nephrin原核表达载体pcDNA3．1 nephrin V5-His,重组质粒经酶切鉴定后测序,并转染至COS-7细胞观察表达情况及生物学特性。结果成功构建pcDNA3．Inephrin—GFP重组质粒,并将Nephtin—GFP融合蛋白成功表达于COS-7细胞,进一步经交联实验证明Nephtin—GFP融合蛋白具有正确的细胞膜表达。结论利用pEGFPN3和pcDNA3．1nephtinV5-His可成功重组Nephrin—GFP表达质粒,为进一步研究肾小球裂隙隔膜分子复合物构成及其功能提供有利工具。