小鼠胎肝造血基质细胞对CFU—E,BFU—E生长的体外调控作用

造血基质细胞是造血微环境的重要成分,它对造血干细胞和祖细胞增殖分化的影响已引起人们重视。本室建立的小鼠胎肝造血基质细胞系(MFLSC)为研究其在调控造血中的意义提供了方便条件。 以往研究证明,MFLSC可向培养上清液中释放多种造血活性物质,将此培养上清代替外源性刺激因子加入到半固体培养体系中可支持红系、粒系或由红、粒、巨噬细胞组成的集落(CFU—EGM)生长。MFLSC本身对CFU-GM生长的调控作用已有报道。本工作观察MFLSC对小鼠骨髓红系造血祖细胞生长的影响,旨在进一步认识小鼠胎肝基质细胞在调控造血中的作用机理。     

人胎肝细胞裂解液对照射小鼠多能造血干细胞的影响

本文采用内、外源脾结节形成测定法和流式细胞术观察了人胎肝细胞裂解液FLL及其峰组分在γ射线照射小鼠多能造血干细胞损伤修复中的作用。证明照后24h给予FLL及峰组分4—5能明显增加受照小鼠残存造血干细胞形成CFU-S的能力,促进处于G1/0期的造血干细胞提前进入增殖状态。     

小鼠胎肝造血基质细胞系对CFU—GM生长的调控作用

利用本实验室建立的小鼠胎肝造血基质细胞系(MFLSC)研究了造血基质细胞对粒-巨噬系造血祖细胞(CFU-GM)生长的影响。实验结果表明,MFLSC对CFUGM集落的生成有双向调控作用,即既有刺激性作用,又有抑制性影响。这种调控有体液因子之中介,亦有细胞与细胞间近距离的效应。文中讨论了MFLSC双向调控CFUGM生长的意义及其机理。     

造血干细胞移植条件对小鼠造血重建的影响

通过同种基因型小鼠构建造血干细胞移植模型,将预处理的全骨髓单个核细胞或c-Kit⁺造血干细胞移植至致死剂量照射的受体小鼠体内,动态监测移植2～16周后受体小鼠体内供体来源细胞造血重建以及嵌合情况,以期揭示不同群体的供体细胞以及预处理等因素对小鼠造血干细胞移植后造血重建的影响。实验结果显示,移植后早期(2周)全骨髓单个核细胞组髓系比例要高于c-Kit⁺细胞移植组,但全骨髓移植组受体小鼠呈现出较大的移植后不良反应,出现脱毛、食欲不振以及体重减轻的症状。c-Kit⁺细胞移植组在淋系重建上要早于全骨髓移植组,供体细胞的嵌合植入也早于全骨髓移植组,但两组实验组最终均能完成造血重建过程。实验结果表明c-Kit⁺细胞移植组在移植后能够较快地实现供体细胞植入,进而开始造血重建,且c-Kit⁺细胞移植组的不良反应要低于全骨髓移植组。结果说明在整体造血重建效果上c-Kit⁺细胞移植组要优于全骨髓移植组。     

在不稳定和相对稳定培养体系中CFU-S生长的动力学观察

利用 Dexter 培养方法,我们在体外对小鼠胎肝进行了长期液体培养。根据换液后悬液细胞总数的不同,建立了不稳定和相对稳定两个培养体系,并利用12d 脾结节检测和单个脾结节转移技术,观察了体系中悬液细胞总数,CFU-S 数及其自我更新的动态变化。表明在不稳定培养体系中,悬液细胞总数和 CFU-S 数增长较快,但由于每周换液时悬液细胞的丢失,可能使体系长时间处于应激状态,其自我更新力衰减也较快。而在相对稳定体系中,由于换液时其悬液细胞的再次种入,使总数保持相对恒定,CFU-S 数的变化比较平缓,其自我更新力的衰减也相对缓慢。提示在造血细胞体外液体培养体系中存在着一种生理性反馈调节活动,但其机理有待进一步研究。     

血小板生成素诱导胎肝CD34^＋造血干／祖细胞增殖分化与周期蛋白表达的关系

为了解胚胎时期巨核细胞增殖分化特有的内在机制,本研究观察了在体外培养体系中,胎肝源CD34+造血干/祖细胞在血小板生成素(thrombopoietin,TPO)作用下增殖分化特征与相关周期蛋白B1、D1和D3表达及细胞内水平变化的关系。结果发现(1)经12d培养后,TPO使胎肝源CD34     

小鼠造血干细胞增殖与分化性能的研究

本文选择Ｙ染色体特异的性别决定基因作为新的细胞遗传标志,采用ＰＣＲ技术研究了小鼠造血干细胞的增殖与分化性能。将雄鼠骨髓细胞输注给经致死剂量射线照射的雌性受体小鼠、ＰＣＲ测试结果表明,所有ＣＦＵ－Ｓ均为供体起源。供体来源的ＣＦＵ－Ｓ在其输入体内后,可通过增殖,分化形成各系造血细胞,但ＣＦＵ－Ｓ中的纤维母细胞和ＣＦＵ－Ｓ重建造血后受体小鼠骨髓中的纤维母细胞均为受体起源。由此可见,小鼠骨髓中的ＣＦＣ－Ｓ     

胎肝造血干细胞的移植特性

胚胎发育中,肝脏是一个重要的造血器官。近年来胎肝移植的临床应用重新引起了人们的关注。本文应用染色体的 C-带染色法研究了小鼠骨髓和胎肝造血干细胞在照射受体小鼠中的增殖能力与相互间的竞争作用。实验结果表明胎肝造血干细胞在成年骨髓中的植入率比较同样条件下的成年骨髓造血干细胞低,但胎肝造血干细胞比较成年骨髓造血干细胞具有更强的自我更新或增殖能力。在同种胎肝造血干细胞移植中,为了降低同种移植抗力,提高移植的胎肝造血干细胞在受体中的耐受性,移植前对受体作适当的免疫抑制处理是必要的。因此,克服个体发育屏障和移植免疫屏障是提高同种胎肝造血干细胞移植效果中两个重要的研究课题。     

小鼠胚胎干细胞定向血管内皮和造血细胞分化体系的建立

目的:建立小鼠胚胎干细胞体外定向分化为血管内皮细胞和造血细胞的体系,并验证诱导后2种细胞的表面分子特征。方法:以小鼠胚胎成纤维细胞为饲养层,首先在无血清培养基StemPro中加入骨形态发生蛋白4(BMP4)、激活素A、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-Basic)和血管内皮细胞生长因子(VEGF),诱导小鼠胚胎干细胞系R1/E 4 d后形成拟胚体;再将拟胚体消化后与OP9-DL1基质细胞共孵育,分别用干细胞因子(SCF)、VEGF和SCF、FLt3、白细胞介素3(IL-3)诱导向内皮和造血2个方向分化,并以CD31、CD45、CD144、Kit、CD201作为表面标志,流式检测诱导后细胞的表面分子特征和诱导效率;诱导10 d后免疫组化染色,进行内皮细胞的形态学鉴定。结果:诱导分化10 d后,免疫组化染色观察到多个内皮管状结构,流式检测CD31^+的内皮细胞比例为1.35%±0.05%,进一步分析CD31^+CD144^+CD45^-群体,有3.0%±0.2%的细胞表型为Kit^+CD201^+,提示该部分细胞可能是处于分化上游的内皮干祖细胞;CD45^+的造血细胞比例为35.0%±0.5%,其中0.35%±0.05%的细胞表达Kit和CD201,提示该部分细胞可能是处于分化上游的造血干祖细胞。结论:本研究将胚胎干细胞诱导为内皮细胞和造血细胞,并且能诱导出具有内皮、造血干祖细胞分子特征的细胞,可作为理想的体外诱导分化体系。     

体外培养的胎肝细胞半同系移植效果的研究

以Dexter体系成功地建立了小鼠胎肝细胞体外长期培养技术。培养的胎肝造血干细胞(CFU-S)有旺盛的增殖力。半同系移植研究证实,5×10~6个培养细胞(含780～1200CFU-S)可使9.5Gy γ-线照射的受体小鼠30d和60d存活率达80％和74％。1个月造血功能恢复。无移植物抗宿主病(GVHD)征象,并在受体内形成了稳定的嵌合体。说明体外培养的胎肝细胞能有效地重建造血。观察小鼠移植后14.5个月的远期疗效,其造血机能健全,体内CFU-S的移植效力与正常相似。然而CFU-S的再生速率和自我更新力均较正常同龄鼠低,揭示出长期增殖状态的造血干细胞功能上的变化。     

体外诱导小鼠胚胎干细胞产生T谱系潜能造血祖细胞的关键步骤

目的:探索体外诱导小鼠胚胎干细胞(mESC)产生具有T淋巴谱系潜能造血祖细胞的关键步骤和操作技巧,进一步明晰及优化诱导策略,提高功能性血液细胞的体外再生效率.方法:将Runx1和Hoxa9串联重组质粒转染mESC产生iR9-mESC,体外依次诱导可先后产生拟胚体(EB)、诱导性生血内皮细胞(iHEC)、诱导性造血祖细胞...     

胎肝造血干细胞在扩散盒培养条件下移植特性的变化

经体内扩散盒培养6d 后的 LACA 小鼠胎肝细胞移植给照射的同系成年小鼠,造血干细胞在受体脾脏和骨髓中的有效植入率比正常胎肝细胞明显提高。但这种效果在同种异基因受体小鼠中则完全消失。实验结果表明,个体发育屏障和移植免疫屏障是决定同种胎肝移植能否成功的两个重要因素。胎肝细胞经体内或体外培养后可以模拟造血干细胞在体内的发育成熟,从而增强对成年造血微环境的适应性。用短期体内培养的方法,可以改变胎肝造血干细胞的某些生理特性,从而减弱个体发育屏障,但不能克服胎肝同种移植中的免疫性抗力。为了保证同种胎肝移植的成功,必须进一步同时克服两种屏障。     

人造血干／祖细胞多态性的研究：Ⅷ.人正常骨髓CD34^＋造血细胞体视学的特征

人ＣＤ３４＋造血细胞是具有高度自我更新,多向分化及重建长期造血与免疫学功能的独特体细胞。为系统探索ＣＤ３４＋造血细胞的形态,细胞化学及超微结构特征,新近我们设计组合并建立了ＣＩＭＳ－１００ＦＡＣＳ４４０无菌二次分选术,可使所获ＣＤ３４＋５造血的纯度达１００％。     

单克隆来源的小鼠胎肝HPP-CFC肝上皮分化潜能的研究

为研究胎肝中造血和肝上皮发育的关系,建立了小鼠胎肝高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFC）培养体系,并进行了单克隆培养以及诱导分化实验.在造血和肝诱导因子的共同作用下,对单克隆来源的HPP集落细胞向造血和肝上皮细胞进行诱导分化,采用透射电镜(TEM)、巢式RT-PCR、细胞免疫荧光检测,从细胞形态、超微结构、上皮细胞分化标志等方面对分化后的细胞进行检测.检测结果显示诱导后的部分细胞具有肝细胞特异性的超微结构并不同程度的表达白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白（CK8,CK18）等肝上皮分化标志,同时还表达间质标志α-SMA和血管内皮细胞标志Flk-1.免疫磁珠分选表明：胎肝来源的HPP-CFC主要来自于CD45⁺细胞,CD45^-细胞不具有形成造血克隆的能力.在肝上皮细胞分化潜能上,流式分选获得的CD49f⁺/Sca-1⁺细胞与未分选细胞无明显差异.该模型的克隆源性通过细胞混合实验进行证明.研究结果表明,改进的胎肝来源的HPP-CFC可能代表了一个新的造血向肝上皮细胞分化的单克隆模型,为研究胎肝中造血和非造血细胞的发育关系提供了一个新的切入点.     

一个能封闭造血祖细胞对重组人IL3反应的单克隆抗体—HI98

本文报道一种抗髓系细胞分化抗原单抗HI98,属于 IgM,与90%以上人外周血粒细胞,72%单核细胞和56%骨髓细胞反应。与一些上皮细胞有交叉反应。HI98单抗能抑制胎肌浸液诱导的人 GM-CFU 集落形成,最大抑制率达75%。用基因重组的 IL3和 GM-CSF纯品研究证实 HI98单抗只能特异性地抑制IL3诱导的 GM-CFU 和 BFU-E 集落形成,而对 GM-CSF 诱导的 GM-CFU 和 BFU-E 集落形成没有影响。因而生物学试验的结果与Lewis 在今年维也纳会议上报告的 IL3结合抑制试验结果完全一致,表明 HI98单抗的特异性是针对人类 IL3受体,一是一个抗 IL3受体抗体;在国内外尚未见报道。为研究人 IL3受体的基因调控及其与造血细胞增殖、分化、癌变之间的关系和造血因子间的相互作用提供了一个重要的工具。     

小鼠LAK细胞对红系祖细胞及多向造血祖细胞增殖的影响

小鼠脾细胞经重组人白细胞介素-2(rhIL-2)激活后对YAC-1,LP-3和WEHI-164等肿瘤细胞均有很强的杀伤活性。在CFU-E和BFU-E培养体系中,不同浓度LAK细胞与BMC直接加入或预温育4h后再培养,均能加强CFU-E和BFU-E增殖。低浓度LAK细胞(LAK/BMC为0.5)与BMC直接加入或预温育后再加入CFU-mix培养体系中,均能增强CFU-mix增殖,而高浓度LAK细胞和BMC(LAK/BMC=8.0)直接加入培养体系则抑制CFU-mix增殖;若共温育后再培养则非常明显地抑制CFU-mix增殖,CFU-mix仅为对照的17.6％。小鼠LAK细胞对造血祖细胞体外增殖具有调节作用,这种调节可能包括分泌某些细胞因子以及细胞间直接相互作用两种方式。     

小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁层对红系祖细胞生长的影响

本实验以Dexter培养体系作小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁培养。在所获的基质细胞贴壁层上作红系造血祖细胞集落培养,观察两种来源造血基质细胞对红系集落生长的影响。实验结果表明,胎肝造血基质细胞贴壁层能明显促进早期红系造血祖细胞(BFU-E)形成集落,却不明显影响晚期红系造血祖细胞(CFU-E)的生长。成年小鼠骨髓造血基质细胞贴壁层对BFU-E和CFU-E均有刺激生长的作用;但对前者生长的刺激性影响较胎肝造血基质细胞贴壁层为弱。造血基质细胞贴壁层对红系集落生长的促进作用主要是通过体液因子实现的,细胞间短距离调节的影响亦不能除外。     

小鼠胎肝间充质干细胞在缺血脑组织中迁移机制的研究

目的：探讨小鼠胎肝间充质干细胞（flMSCs）在缺血脑组织中迁移的机制。方法：分离和培养小鼠flMSCs,制备小鼠脑缺血再灌注模型,RT-PCR方法检测小鼠flMSCs表达的趋化因子受体及其唯一配体基质细胞来源因子1α（SDF-1α）在缺血损伤脑组织中的n1RNA表达;Westernblot检测SDF-1α蛋白在缺血损伤脑组织中的表达;免疫组织化学检测SDF-1α在缺血损伤脑组织中的表达和分布;Boydenchamber法进行SDF-1α诱导flMSCs迁移的体外实验。结果：flMSCs经RT-PCR检测表达趋化因子受体CR1,CR3,CXCR1,CXCR2,CXCR3,CXCR4。脑缺血损伤侧脑组织SDF-1αmRNA表达显著增高,与正常脑组织SDF-1αmRNA比,具有显著差异（P〈0．01）,Westernblot检测显示缺血侧脑组织SDF-1α蛋白表达量在12、24、48h分别为0．35±0．05,0．88±0．04,0．74±0．07,与正常脑组织SDF-1α蛋白（0．22±0．04）比,差异有显著性（P〈0．01）。免疫组织化学检测显示,缺血损伤后24h,缺血侧脑皮质,海马等缺血边缘区SDF-1α表达显著增高,缺血对侧及正常脑组织未见明显SDF-1α表达。体外迁移实验显示SDF—1α体外可以趋化flMSCs发生迁移,CXCR4阻断抗体可以阻断SDF—1α诱导flMSCs发生的迁移。结论：SDF-1α可以诱导flMSCs发生迁移,趋化因子受体CXCR4及其配体SDF-1α的相互作用是flMSCs在缺血损伤脑组织中迁移的机制之一.