一株能在苜蓿上结瘤的费氏中华根瘤菌

费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii) 0 4 2BS分离自新疆的苜蓿根瘤 ,通过交叉结瘤试验 ,发现它既可在苜蓿上又可在大豆上结瘤固氮。 1 6SrDNAPCR RFLP分析表明 ,0 4 2BS与费氏中华根瘤菌模式菌株USDA2 0 5的 4种限制性酶切图谱完全一致。其G +Cmol%为 60 0 ,与费氏中华根瘤菌USDA2 0 5和USDA1 91的DNA同源性分别为 84 9%和89 6% ,表明 0 4 2BS属于费氏中华根瘤菌。应用绿色荧光蛋白基因标记 0 4 2BS ,得到重组菌株 0 4 2BSG。将其接种保定苜蓿和北引 1号大豆 ,并重新分离出根瘤菌 ,利用激光共聚焦荧光显微镜检测到标记基因的表达 ,从而确证了 0 4 2BS能在苜蓿和大豆上结瘤。而且 ,0 4 2BS对不同苜蓿品种的结瘤能力不同     

苜蓿中华根瘤菌042B共同结瘤基因nodABC的克隆与序列分析*

根瘤菌的nodABC和nodD在结构和功能上保守,在不同的菌种之间能够互换〔1〕,是目前所有供试的豆科植物结瘤所必不可少的,称为共同结瘤基因。另一类是寄生专一性结瘤基因,如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的nodPQ等〔2〕,这些基因决定根瘤菌能与哪些种属豆科植物结瘤〔3〕。根瘤菌的结瘤呈寄主专一性,例如苜蓿中华根瘤菌的寄主范围很窄,仅能在苜蓿、草木樨和葫芦巴3个属的豆科植物结瘤〔4〕。但在1995年。本实验室从新疆苜蓿分离到一株菌株042B,既能在大豆又能在苜蓿上结瘤．而且在大豆上具有较高的共生效率〔5〕。本文拟克隆其nodABC,并与其他菌株nodABC序列进行比较,以阐明042B能在大豆和苜蓿结瘤的分子机制。     

紫云英根瘤菌Ra159的巨大质粒上存在有nod和nif基因的证明

在紫云英根瘤菌(Rhizobium astragali)Ra159中存在有两个分子量分别约为300Md(pRal59a)及大于300Md(pRal59b)的巨大质粒。以肺炎克氏杆菌的固氮酶结构基因nifHDK片段和苜蓿根瘤菌共同结瘤基因nod ABCD片段作探针进行的杂交试验证明了紫云英根瘤菌的大质粒pRal59b上存在有nod基因和nif基因。将这些大质粒转移到nod—nif基因缺失的苜蓿根瘤菌突变株Rm627—1,只有带pRal59b的转移接合子能在紫云英植物上形成根瘤,但这些根瘤均不能还原乙炔。     

苜蓿中华根瘤菌Sm NifA蛋白与阴沟肠杆菌Ec NifA蛋白功能差异的研究

nifA基因是固氮基因nif的调节基因, 其产物NifA蛋白是固氮过程的中心调节因子. 将多拷贝组成型表达的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti, Sm) nifA基因或阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae, Ec) nifA基因引入苜蓿中华根瘤菌野生型菌株Sm1021和苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY中, 并检测这些苜蓿中华根瘤菌感染苜蓿之后根瘤的表型及固氮酶活性. 实验结果表明, 苜蓿中华根瘤菌NifA蛋白和阴沟肠杆菌NifA蛋白在苜蓿中华根瘤菌中的功能有明显差异. 在野生型菌株Sm1021中, 引入多拷贝Sm nifA基因对宿主根瘤固氮效率的促进作用明显优于引入多拷贝Ec nifA基因的作用. 引入多拷贝Sm nifA基因的SmY菌株(nifA突变型)能够共生固氮, 而引入Ec nifA基因的SmY菌株仍然不能固氮. 氨基酸序列同源性分析显示, N末端结构域是Sm NifA蛋白和Ec NifA蛋白同源性最低的功能域. 进一步研究表明, Sm NifA蛋白的N末端结构域在互补苜蓿中华根瘤菌nifA突变型菌株SmY的固氮功能时是必需的.     

费氏中华根瘤菌共生质粒扩增对结瘤因子组分和共生固氮能力的影响

费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)YC4能在大豆(Glycine max)和野大豆(G．soja)上形成正常固氮的根瘤．人工培养条件下用^14C标记的薄层层析(TLC)法检测根瘤菌产生的结瘤因子(LCOs)的结果表明,与其它4株费氏中华根瘤菌相比,YC4产生的LCOs含有较多的疏水性基团．从YC4菌株中分离到1株共生质粒发生了扩增的自发突变株YSC3,其产生的LCOs中含有较野生型菌株多的1个疏水性组分,28℃培养条件下产生的LCOs量亦较YC4显著增加．结瘤试验结果表明,YSC3菌株只能在大豆和野大豆上形成无效的根瘤．     

Tn5—Mob转座系统对紫云英根瘤菌SR72的诱变和诱动作用

通过接合作用将携带有转座子 Tn5—Mob 的“自杀”性载体质粒 pSUP5011引入紫云英根瘤菌 SR72,得到卡那霉素抗性(Km~r)菌落的频率为6.99×10~(-6),测得受体菌的 Km~r 自发突变频率<10~(-8)。从对1071个 Km~r 突变体进行的植物砂培结瘤试验中筛选出结瘤不固氮(Nod~ ,Fix~-)突变株17个,不结瘤(Nod~-)突变株4个。另外,还从近3000个 Km~r 突变体中选出腺苷营养缺陷型突变株3个。通过 Tn5探针进行的菌落原位杂交试验证明:这21个共生固氮突变株中均含有 Tn5序列,进一步通过接合作用将协助质粒 RP4—4(Tc~r)引入 Nod~ ,Fix~ 突变株,获得了含有 Tn5—Mob 和 RP4—4的新突变株 SR72ZR(Km~r,Tc~r),但试图通过它们的协同作用将SR72中的大质粒诱动转移到根癌农杆菌 A136的试验未获成功.     

超慢生型大豆根瘤菌的生理生化和共生特性的研究

超慢生型大豆根瘤菌(ESG,extra—slow-gfowing soybean rhizobium)是不同于大豆另两类共生体——慢生型大豆根瘤菌(Bradyhizobium,japonicum)和快生型大豆根瘤菌(Sin-orhizobium fredii)的新类群。它们在生长速率和生理学特性等方面均表现出较大的差异。根瘤类菌体的扫描结果表明,ESG的类菌体形态为杆状,与另外两群相近,但发现有“Y”形类菌体。ESG利用碳源范围较窄,抗生素自然耐受性比慢生型低,在柠檬酸盐培养基上不生长;代时超长,已测定的7个菌株代时为23．3-41．9h。细胞成分N,c分析结果表明,ESG在三个类群中N含量最高,C含量最低。温室盆栽试验证明ESG中大部分菌株的固氮酶活性和植株含氮量与生产用菌株相当。ESG菌株可以在绿豆上结瘤并有固氮酶活性。     

紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离

以紫云英根瘤菌菌株7653R为材料,制备总DNA,经EcoRⅠ限制酶部分酶解,通过10—50％蔗糖梯度离心,分离到20一30 kb的DNA片段。利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱寄主载体——pLAFRl质粒,构建了紫云英根瘤菌基因文库。通过与苜蓿根瘤菌102l菌株中8．7kb的共同结瘤基因(作探针DNA)杂交,从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段。以紫云英根瘤菌不结瘤突变株7653R+1(7653R消除共生质粒)为受体、构建的7653R基因文库(E．Coli C600)为供体,通过协助转移质粒pRK2013(LE392)进行三亲交配,在含四环素的根瘤菌台成培养基(sM)上选择接合转移子。将得到的所有接台转移子混合在一起接种植物,通过植物结瘤试验,分离到含紫云英根瘤菌结瘤基因的重组质粒pRaz15。将该质粒用EcoRⅠ完全酶切,得到25kb左右的外源DNA片段,该片段携带完整的结瘤基因簇。     

费氏中华根瘤菌内源质粒的不相容性及其在质粒消除中的应用

用Tn5 Mob sacB转座子标记费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii)HN0 1和WWG1 8的内源质粒 ;在含有 1 0 %蔗糖的TY培养基上进行了质粒消除试验以鉴定其功能。将HN0 1的标记共生质粒pSymHN0 1b转入费氏中华根瘤菌WWG1 8SR和C361SR中 ,质粒快速检测、质粒消除和植物盆栽结瘤试验结果证明 :HN0 1的共生质粒与WWG1 8SR的共生质粒具有不相容性 ,但能与其非共生质粒相容。相反 ,HN0 1的共生质粒可与C361SR的共生质粒相容 ,但与其中一个非共生质粒具有不相容性。利用费氏中华根瘤菌不同菌株质粒间的不相容性 ,本研究成功地消除了WWG1 8SR的共生质粒和C361SR的一个非共生质粒。     

海南快生根瘤菌I66的部分16S rRNA序列测定

与豆科植物共生固氮的根瘤菌目前有4个属、10个种.包括Rhizobium(6个种),Sinorhizobium(2个种),Azorhizobium(1个种)和Bradyrhizobium(1个种).其中多数是近年来采用现代分类技术分析后建立的,而且新的类群还在不断被发现.在以前的根瘤菌数值分类及DNA-DNA杂交研究中,我们确定了海南慢生型根瘤菌属于大豆慢生根瘤菌种(B.japonicum).而海南快生型根瘤菌的分类地位则较为分散.其中一些菌株属于已知各根瘤菌种,另有4株银合欢根瘤菌和13株来自不同寄主的菌株分别构成具有独立的分类地位的两个菌群(第2群和第4群)(待发表).为了进一步明确它们的分类地位,我们依据国际系统细菌学委员会根瘤菌分委员会的建议,利用Young等建立的聚合酶链反应(PCR)及测序技术,对第4群的代表菌株166的部分16SrRNA基因片段进行了扩增和测序.     

苜蓿中华根瘤菌042BMnoeA基因的克隆、敲除与功能的初步分析

通过PCR扩增获得了042BM的noeA基因。该基因与苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)1021noeA的同源性为99%,而其NoeA与1021NoeA的相似性为97%。还发现其NoeA与中慢生根瘤菌（Mesorhizobium sp.）BNC1可能的SAM_依赖性的甲基转移酶相似性为32%,而其303～362氨基酸区域与大肠杆菌（Escherichia coli）的核糖体50S亚基的L11蛋白甲基转移酶(PrmA)的160～220氨基酸区域的相似性达到41%。通过插入卡那盒,敲除noeA,获得突变株042BMA_Km。与苜蓿中华根瘤菌042BM相比,敲除noeA的突变株在普通紫花、保定、宁夏、百发和傲汉苜蓿品种上的结瘤数、根瘤鲜重和植株地上部分的干重都有不同程度的增加,而在秘鲁苜蓿品种上的结瘤数和植株地上部分的干重明显下降,在皇后和美国杂花苜蓿品种上则没有明显的变化。     

几类快生型根瘤菌质粒的研究

用一种重现性好而较简便的方法,对国内的紫云英、豌豆、三叶草、大豆等快生型根瘤菌及根癌农杆菌共40多号菌进行了质粒分离,所得质粒图谱具有一定的菌株特异性。每株菌有1—3个质粒,其中至少有一个大质粒或巨大质粒。用质粒消除法获得失去结瘤(或致癌)能力的变异株,均缺少一个大质粒。快生型根瘤菌的结瘤基因定位在大质粒或巨大质粒上。用接合法将Rpl：：Tn501等质粒转入根瘤菌中,能诱动根瘤菌的结瘤基因转移给失去结瘤能力的变异株,可表达功能,质粒图谱也发生变化,与供体或受体都不同。     

导入dctABD和nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮的影响研究

以pTR102为载体构建重组质粒pHN307,其上克隆有来自昔蓿中华根瘤菌（Sinorthizobium meliloti）的四碳二羧酸转移酶基因dctABD、来自肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae）的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶基因lux-AB。经三亲本接合转移,将pHN307导入费氏中华根瘤菌（S.fredii)NH01、YC4和GR3,并考察了转移接合子中pHN307在传代培养和共生条件下的稳定性。与出发菌相比较的植物盆栽试验结果表明,在与大豆黑农33共生时,导入pHN307后的转移接合子均可显著提高结瘤植株的瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量。在与大豆川早一号共生时,转移接合子HN01（pHN307）可显著提高结瘤植株的瘤数和瘤重;GR3（pHN307）可显著提高结瘤植株的瘤数、瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量;导入pHN307的YC4却呈现出负作用。本研究表明,导入dctABD可提高固氮效率     

紫云英根瘤菌共同结瘤基因nodA和nodBC的核苷酸序列

以~(32)p标记的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)2.3kb nod DNA作探针,从紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R. astragali)159基因文库中分离到一株能与探针DNA呈阳性反应的克隆pRaN109。同源DNA-DNA杂交及DNA序列分析表明:pRaN109DNA的9kb EcoRI片段上携带了nodD_1BC基因,pRaN109 NDA的18kb EcoRI片段上携带了nodD_2A基因。共同结瘤基因nodA与nodBC两者相距6.7kb。在nodA基因和nodBC基因的上游都存在有结瘤盒(nod box)。与来自不同种属的菌株所报告的结果相比较,紫云英根瘤菌159中的共同结瘤基因有着明显不同的组合。     

Tn5-Mob系统诱导耐盐基因转移

利用转座子Tn5-Mob和辅助转移质粒R68.45将放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）生物变型1（biovar 1）菌株PDDCC5785的耐盐基因转移到快生型大豆根瘤菌（Rhizobium fredii）USDA 191中,获得转移接合子,提高了根瘤菌的耐盐能力。随机挑取27个转移接合子进行结瘤试验,其中3株能够结瘤固氨。本研究为根瘤菌的遗传改造提供了一个有用的手段。     

豇豆根瘤菌NGR234和紫云英根瘤菌109感染紫云英的比较研究

利用光学和电子显微镜对紫云英根瘤菌菌株109和广宿主的快生型根瘤菌菌株NGR234感染温带型豆科植物紫云英进行了研究,结果表明根瘤菌感染紫云英是通过在根毛中形成侵染线的途径。电子显微镜研究揭示了固氮根瘤中细胞内侵染线的存在。接种二天后,首先可观察到根毛的卷曲或分枝。接种四至五天后,在每株植物卷曲的根毛中可看到侵染线。接种八至十天后的植株出现肉眼可见的根瘤。菌株NGR234能够在紫云英上诱导根毛的卷曲,侵染线和根瘤的形成,但所形成的根瘤却未能固氮,根瘤中无明显的类菌体区,但有少数包有细菌的侵染线。NGR234抗抗菌素的衍生菌均未能使紫云英结瘤。将NGR234的共生质粒转移至三叶草、苜蓿、豌豆、快生型大豆根瘤菌和农杆菌,亦未能使这些细菌获得紫云英上结瘤的能力。     

固氮酶结构基因在快生型大豆根瘤菌中的定位

分离纯化了一批我国快生型大豆根癌蘸。测定了它们的固氮酶稀性和寄主专一性,发现相同菌株在不同大豆豆种植株上的结瘤和固氮活性差异甚大。蓑国USDA 191和193似寄主专一性较高,在我们所使用的豆种上结瘤能力很低,固氮活性也不高。对根瘤菌中巨型质粒的数量分布进行了分离分析,表明所有快生型大豆根瘤菌都包含1—3个巨型质粒(分子量范围;30-25Md>。用含有固氮酶结构基因的质粒pSA30作为探针对巨型质粒进行杂交,结果表明即使是快生型大豆根瘤菌,固氮酶结构基因也并不一定定位于巨型质粒上。另外,在若干菌株中发现psA30与二个巨型质粒同时杂交,表明有可能nif HDK或其部分基因的拷贝是分散的。     

豌豆根瘤菌共生基因pJB5JI与华癸中生根瘤菌7653R共生质粒的相互关系

华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R是分离自我国南方水稻田的一株根瘤菌,含有2个内源质粒:p7653Ra和p7653Rb,其中7653Rb是共生质粒.通过Tn5-sacB的插入方法来消除质粒,获得7653Rb消除的突变株7653RD.将豌豆根瘤菌T83K3的共生质粒pJB5JI导入7653R和7653RD中,盆栽结果表明含有pJB5JI的转移接合子7653R-197的竞争结瘤能力和共生固氮能力均高于7653R.pJB5JI不能恢复7653RD在紫云英上的结瘤能力.含有pJB5JI的7653RD可以在豌豆上结无效瘤,表明pJB5JI可以在7653R的染色体背景下表达其功能.对转移接合子中的质粒稳定性进行检测,结果表明pJB5JI在人工传代的情况下可以稳定存在,但经过共生之后发生了遗传分离,对转移接合子和出发菌株及分离菌株进行kan基因的PCR扩增,除了受体菌外其他菌株都可得到PCR产物,由此推测,pJB5JI可能部分或全部整合到了受体菌的染色体基因组中.     

华癸中生根瘤菌2020三个内源质粒的功能及其与豌豆根瘤菌共生质粒之间的相互关系

2020是一株分离自中国南方水稻田里的华癸中生根瘤菌（Mesorhizobiumhuakuii）,有3个内源质粒,分别命名为p2020a,p2020b和p2020c．用Tn5-sacB插入突变的方法对2020进行质粒消除,得到了两株质粒缺失突变株20201）29和2020D8．缺失了第一大质粒p2020c的突变株2020D29的结瘤固氮能力有显著的提高;而缺失了第二大质粒p2020b的突变株2020D8失去了在紫云英（Astragalus sinicus）上结瘤的能力;第三大质粒很难被消除,原因可能是该质粒上含有菌株生长所必需的基因．然后将豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）的共生质粒pJB5JI转入2020及其质粒缺失突变株中,盆栽结果显示,2020-137（pJB5JI）的竞争结瘤能力和固氮能力显著高于2020．但是pJB5JI不能恢复2020D8在紫云英上的结瘤能力．2020D8—8（pJB5JI）可以在豌豆（Pisum sativum Linn）上形成无效瘤,这说明pJB5JI的功能可以在2020的遗传背景下进行表达．对pJB5JI在受体菌中的稳定性进行检测,结果发现在人工传代的情况下pJB5JI可以稳定的存在,但经过与植物共生之后只能在部分根瘤分离物中检测到pJB5JI,对这些转移接合子和出发菌株及分离菌株进行Km基因的PCR扩增,除了出发的受体菌外其余的菌株都可以得到PCR产物．由此推断,在没有检测到pJB5JI的分离株中,pJB5JI可能部分或全部整合到了受体根瘤菌的染色体DNA中．     

华癸中生根瘤茵7653R共生质粒pMH7653Rb的不相容性行为

摘要华癸中生根瘤菌菌株7653R含有2个内源质粒（pMH7653Ra,pMH7653Rb）．用三亲本杂交法将7653R的共生质粒pMH7653Rb分别导入HN308SR（Sm^r,Rif^r;含pMHHN308a,pMHHN308b和pMHHN308c）和HN3015SR（Sm^r,Rif^r;含pMHHN3015a,pMHHN3015b和pMHHN3015c）．发现受体菌HN308SR的两个稳定内源质粒pMHHN308b和pMHHN308c随着pMH7653Rb的导入而同时被消除．该接合子命名为HN308SRN14．这一结果表明pMH7653Rb与pMHHN308b和pMHHN308c不相容,可以归于同一不相容群．另一转移接合子HN3015SRN14的质粒图谱显示其第二大质粒pMHHN3015b由于pMH7653Rb的导入而被消除．该结果表明,pMH7653Rb与pMHHN3015b不相容．植物结瘤实验结果表明,pMH7653Rb的导入能恢复HN308SRN14的结瘤能力,其结瘤数目超过HN308SR,但不能替代pMHHN308b和pMHHN308c的固氮作用,HN308SRN14失去了固氮能力．质粒消除突变株HN308SRNl4D只含有pMHHN308a,能形成少量无效根瘤,确认pMHHN308a与HN308的结瘤能力有关．HN3015SRN14（含pMH7653Rb,pMHHN3015a和pMHHN3015c）只能形成无效根瘤,而质粒消除突变株HN3015SRN14D（仅含pMHHN3015a和pMHHN3015c）则完全失去结瘤能力．通过PCR反应从7653R,HN308,HN3015,HN308SRN14,HN3015SRN14中均检测到质粒复制基因repC．供试菌株的repC基因序列相似性达到99％．