粉防已碱与钙调蛋白相互作用的荧光光谱研究

粉防已碱Tet是一种新的钙调蛋白(CaM)拮抗剂,它抑制CaM活化的Ca~(2 )—Mg~(2 )—ATP c。利用丹磺酰钙调蛋白(D—CaM)可方便地鉴测Tet与CaM的相互作用,直接证明了在CaM与Tet之间生成复合物CaM—Tet 我们制备的D—CaM,每个蛋白分子含1.3个丹磺酰基团,活化红细胞膜Ca~(2 )—Mg~(2 )—ATP c的生物活性与天然CaM基本相同。 当Ca~(2 )与D—CaM结合时,丹磺酰基团环境疏水性增加,该荧光团产生较高的量子产率(增加1.6倍),最大发射兰移(从512移兰至495nm)。存在Ca~(2 )时,Tet使D—CaM的荧光强度进一步增加,谱线继续兰移,表明Ca~(2 )及Tet诱导蛋白构象变化,改变了丹磺酰基团的微环境。 荧光滴定实验证明CaM与Tet结合的解离常数为1.8μM,两者的结合是绝对依赖Ca~(2 )的。 药物Tet与CaM的结合可增强结合在CaM上的荧光探剂NPN的荧光,提示CaM不同疏水结合位之间存在变构相互作用。     

酸枣仁皂甙A与钙调蛋白相互作用的荧光光谱研究

文中报导了本实验室最近发现的一种新型钙调蛋白(CaM)天然拮抗剂——酸枣仁皂甙A,它能显著地抑制CaM活化PDE的活力.为研究它与CaM间的相互作用,本实验还制备了与天然CaM具有相同激活PDE能力的丹磺酰钙调蛋白(D-CaM).D-CaM的荧光光谱研究表明,酸枣仁甙A的加入诱导CaM分子的疏水位点更加暴露,从而增强丹磺酰基团的荧光发射量子产率.桔抗剂与CaM间的结合是绝对依赖Ca~(2 )的.荧光滴定的结果证明此结合的解离常数为2.8μM.酸枣仁皂甙A能进一步加强三氟啦嗪(TFP)所诱导的D-CaM荧光增强.这结果暗示,它不与TFP竞l争CaM上相同的结合位点.     

蜂毒肽片段的合成及其与钙调蛋白的相互作用

采用固相法设计合成了４个蜂毒肽片段：Ｍｅｌ１２、Ｍｅ１１３、Ｍｅｌ１４、Ｍｅｌ１５。应用电泳技术,抑制钙依赖性的磷酸二酯酶酶活方法和荧光技术研究了这些多肽与钙调蛋白的相互作用。结果表明这些多肽与钙调蛋白均形成１：１复合物,抑制钙依赖性的磷酸二酯酶的活性,其中Ｍｅｌ１４和Ｍｅｌ１５对钙调蛋白的结合活性与完整的蜂毒肽比较接近。     

O-丹磺酰基小檗胺与钙调蛋白的相互作用

粉防己碱和小檗胺等一些双苄基异喹啉化合物是一类新型的钙调蛋白(CaM)拮抗剂。为了研究这些化合物同CaM的相互作用,我们用化学修饰的方法将疏水性荧光探针丹磺酰基团接到小檗胺上生成O-丹磺酰小檗胺(DB)。发现这种新的化合物不仅具有荧光特性,而且也是一种较强的CaM拮抗剂。DB抑制依赖CaM的红细胞膜Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase的活性,其IC_(50)值(半抑制数)为2.4×10~(-6)mol/L。     

蜂毒肽片段的合成及其与钙调蛋白的相互作用

采用固相法设计合成了４个蜂毒肽片段，Ｍｅｌ １２，Ｍｅｌ １３，Ｍｅｌ １４，Ｍｅｌ １５。应用电泳技术，抑制钙依赖性的磷赖性的磷酸二酯酶酶活方法和荧光技术研究了这些多肽与钙蛋白的相互作用，结果表明这些多肽与钙调蛋白均形成１：１复合物，抑制钙依赖性的磷酸二酯酶的活性，其中Ｍｅｌ １４和Ｍｅｌ １５对钙调蛋白的结合活性与完整的蜂毒肽比较接近。     

利用I-Mutant2.0辅助设计与优化中东呼吸综合征冠状病毒融合抑制多肽

Ⅰ型膜融合蛋白(class I membrane fusion protein)在Ⅰ型包膜病毒入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。基于抑制六螺旋结构形成的多肽类融合抑制剂设计的原理是模拟该蛋白融合区域的自身序列,与病毒融合蛋白结合形成异源六聚体,从而阻断病毒与靶细胞膜的融合。此类融合抑制剂的传统设计主要基于一级与二级结构,但为进一步强化其抗病毒活性,通常需依赖病毒膜融合蛋白三级结构信息,从而限制了对那些尚无病毒蛋白三级结构信息的新发病毒的多肽类融合抑制剂的快速优化和研发。本研究提出了不依赖蛋白三级结构信息,而利用I-Mutant2.0软件来辅助设计和优化多肽类病毒膜融合抑制剂的设想。根据I-Mutant2.0的预测结果,以中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)为模型,分析该病毒HR2区融合抑制剂序列中若干适合与不适合优化的位点,并设计了一系列多肽。结果发现,对适合优化的位点进行调整的多肽,其对HR1的结合能力及对病毒的抑制活性均有所提升;反之,多肽活性明显下降。结果表明,利用I-Mutant2.0辅助设计与优化病毒融合抑制多肽的方法具有一定的可行性,为进一步开发新的融合抑制剂设计方法奠定了基础。     

模拟α-螺旋多肽类似物抑制剂设计的研究进展

抑制剂筛选主要是通过反复、高通量地筛选化合物库,这个过程存在着对已有化合物库的依赖性和一定的机遇性。通过分析蛋白质数据库(PDB)发现,大多数蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)界面以α-螺旋结构为主体。α-螺旋多肽的骨架结构及其热点氨基酸残基(hotspots)为高效理性设计小分子抑制剂提供了模板。对近几年来依据多肽类似物和小分子化合物模拟α-螺旋结构设计抑制剂的研究进展进行了概述,同时对依据模拟α-螺旋设计抑制剂骨架的结构原理进行了讨论。     

胸苷酸合成酶mRNA亲和多肽的鉴定及其对翻译过程的抑制作用

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)是催化生物体内胸苷酸合成所必需的酶, 多年来一直作为肿瘤化疗的靶点. 研究表明, TS是一种RNA结合蛋白, 可以与其自身mRNA的2个位点结合, 使mRNA翻译受阻. 本文以mRNA体外展示技术进行了由大容量多肽库(>10¹³)中筛选胸苷酸合成酶mRNA亲和多肽的研究, 对随机库进行了12轮循环的选择及扩增. 结果表明, 与初始库相比, 经选择循环之后, 碱性氨基酸及芳香族的苯丙氨酸含量明显增加, 它们在TS RNA与蛋白质的相互作用中扮演着重要角色. 按其理化特性对每一随机位点的氨基酸进行分类, 并与初始库比较, 发现位点1, 12, 17和18具有明显的带正电荷的特性, 表明碱性侧链参与了与RNA的结合. 二级结构预测表明, 随着筛选的进行, 与TS mRNA 亲和的多肽显示出明显的螺旋倾向, 而且形成螺旋的区域富含碱性氨基酸. 凝胶迁移及体外翻译实验证实, 选择循环之后的多肽能够与TS mRNA高度亲和, 并能抑制TS mRNA的翻译. 本研究表明mRNA体外展示方法得到的亲和多肽可以用作新的TS RNA的翻译抑制剂, 并有可能成为一类新型的抗肿瘤药物.     

肌巨蛋白PEVK多肽片段的结构与功能

肌巨蛋白(titin)中的PEVK多肽片段含有多个由26-28个氨基酸残基组成的重复单元,这些重复单元被认为是该多肽片段的结构与功能单位。对不同PEVK片段的构象分析表明,PPⅡ型螺旋、转角和卷曲可能是其三种主要的构象。功能方面,PEVK片段不仅对肌巨蛋白的弹性有很大贡献,而且通过与其他肌肉蛋白的作用在肌肉弹性和组成方面起作用。     

脱脂蛋白A—I模型多肽与脂质体的相互作用

根据脱脂蛋白的脂结合序列合成了２个两新性多肽Ａｍｐ１和Ａｍｐ２,Ａｍｐ２以缬氨酸残基取代了Ａｍｐ１第４位的赖氨酸残基。内源荧光光谱包埋钙氯黄素的脂质体的渗漏、磺化物和丙烯酰胺对多肽色氨酸残基的淬灭、圆二色谱以及用自旋标记的磷脂测定 多肽色氨酸残基的插膜深度等研究均表明。     

牛胰多肽对急性胰腺炎大鼠胰组织中磷脂酶A和胰蛋白酶活性的影响

以0.25％牛磺胆酸钠-0.25％胰蛋白酶溶液注入大鼠胰导管制备急性(出血坏死性)胰腺炎模型。观察剂量为 3μg/kg的牛胰多肽(BPP)对胰腺炎大鼠胰组织磷脂酶 A(PA)活性、钙含量、胰蛋白酶活性以及血清α_1-抗胰蛋白酶抑制力(STIC)的影响。结果如下:1.在伴注BPP的胰腺炎组,PA 活性、钙含量、胰蛋白酶活性及STIC 分别降为胰腺炎组的51％(P<0.001),75％(P<0.001)、20％(P<0.001)以及24％(P<0.001);2.在伴注碳酰胆碱的胰腺炎组,上述四项指标的水平升高。但在伴注碳酰胆碱及BPP 两者的胰腺炎组却分别降至伴注碳酰胆碱的胰腺炎组的39％(P<0.005)、51％(P<0.001)、40％(P<0.001)以及 59％(P<0.001);3.在伴注Ca~(2 )的胰腺炎组,上述四项指标剧升,注射 BPP对其无影响。结果提示,BPP 能降低大鼠胰组织内磷脂酶A 和胰蛋白酶活性及胰内钙沉积量。机制可能与 BPP打断胰酶活化链有关,是否还影响腺泡细胞膜上M受体的功能,有待探讨。     

植物DREPP基因家族研究进展

发育调节质膜多肽(DREPP)蛋白是一类与质膜相关的植物特异性蛋白, 具有结合磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP_s)、Ca ²⁺/钙调蛋白(CaM)复合物、微管和微丝等多种功能, 在植物生长发育与逆境(低温和干旱等)应答过程中发挥重要作用。该文综述了植物DREPP家族成员的组成、蛋白质序列特征及其在发育与逆境应答过程中的生物学功能, 以期为深入认识DREPP参与的信号调控网络提供帮助。     

植物DREPP基因家族研究进展

发育调节质膜多肽(DREPP)蛋白是一类与质膜相关的植物特异性蛋白, 具有结合磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP_s)、Ca ²⁺/钙调蛋白(CaM)复合物、微管和微丝等多种功能, 在植物生长发育与逆境(低温和干旱等)应答过程中发挥重要作用。该文综述了植物DREPP家族成员的组成、蛋白质序列特征及其在发育与逆境应答过程中的生物学功能, 以期为深入认识DREPP参与的信号调控网络提供帮助。     

葛仙米血红素氧合酶基因Ns-HO1异源表达及其蛋白结构模拟

为明确葛仙米(Nostoc sphaeroides)中血红素氧合酶(Heme oxygenase, HO)基因编码蛋白的分子进化地位和高级结构, 克隆该基因并进行原核细胞表达, 氨基酸序列比对与分子进化分析和Swiss-model高级结构模拟。结果显示: 葛仙米血红素氧合酶基因Ns-HO1密码区全长为678 bp, 预编码一含225个氨基酸的蛋白质; Ns-HO1与同源蛋白氨基酸相似性达90.3%, 存在少部分位点替换突变, 但底物血红素的预结合位点(如Arg10和Tyr125)及金属离子结合位点(His17)等关键位点的氨基酸保持稳定。 构建表达载体, 葛仙米Ns-HO1在大肠杆菌中成功诱导表达, SDS-PAGE检测目的蛋白大小近26.0 kD; 分子进化树分析显示Ns-HO1与普通念珠藻、发状念珠藻中同源蛋白聚类于同一分支, 并与点状念珠藻中同源蛋白具有共同祖先。Ns-HO1蛋白多肽链形成8个主要α-螺旋,其中N和C末端的两个α-螺旋与第四螺旋共同为Ns-HO1高级结构提供底面支撑, 其他螺旋围绕该底面进一步延展并充填其中, 形成Ns-HO1分子的类夹心式结构。在高级结构中, 含血红素预结合位点氨基酸的几个螺旋(第一、 五和七螺旋)位于Ns-HO1分子外围, 这些分支螺旋为形成Ns-HO1夹心空间以利于底物血红素锚定和产物及时释放提供了条件。总之, 研究为深入了解与运用葛仙米血红素氧合酶基因的生物学功能和资源提供了基础。     

病毒多肽研究进展

西德慕尼黑大学Pettenbofer研究所的wolf教授最近访问了预防医学科学院病毒所,他在报告中介绍了他们运用计算机程序分析病毒蛋白结构、寻找抗原位点、指导多肽合成等方面的新进展。他们的分析程序不仅限于分析氨基酸顺序,寻找其中的疏水区、亲水区,也不是只停留在对二级结构中的β-片层式转折及α-螺旋结构的确定,而是引入了更多的诸如肽链分子的表面特性,各肽链区段在空间结构中的可塑性及变化     

血源性Dane颗粒的多肽分析

采用PAGE-Western Blot技术对血源性Dane颗粒的多肽组份进行了分析。并结合HBV感染的其它血清学指标,初步探讨了HBV感染者对这些多肽的抗体应答情况及意义。结果显示:Dane颗粒在PAGE图谱上有12条多肽表型;Western Blot证实除S区的6条多肽和来自C区的具有cAg和eAg两种抗原位点的同一多肽P21外,还有与抗Pol结合的P24-25多肽以及与抗人免疫球蛋白结合的多肽(P45-IgC,P76-IgM),推测血源性Dane颗粒上可能存在有Pol基因表达的产物和结合在表面的人免疫球蛋白或相似的抗原决定簇。调查29例隐性HBV感染自限后人群和185例HBV现症感染者对这些多肽的应答情况发现:P24、P27、P39、P42是引起免疫应答的多肽,两组对它们时应答存在着差异(P<0.01)。表明对它们的有效应答可能有利于HBV感染的清除。     

果蝇TRP离子通道C端一个新钙调蛋白结合位点的鉴定和分析

瞬时受体电位(TRP)通道是一类钙离子透过性的阳离子通道蛋白家族,参与了视觉、味觉、温度感受等重要的生物学过程。之前的研究表明,钙离子既能够正反馈也能够负反馈地调节瞬时受体电位通道的活性,而这种调节可能是通过钙调蛋白（calmodulin,CaM）与TRP通道的相互作用来进行的。为了阐明这一调控机制,我们首先需要对钙调蛋白与瞬时受体电位通道之间的相互作用进行详细的生化研究。在此项研究中,通过大肠杆菌表达系统,表达和纯化了果蝇瞬时受体电位通道羧基末端不同长短的蛋白片段,并发现了一个新的钙调蛋白结合位点。通过快速蛋白液相色谱、静态光散射以及等温量热滴定技术,鉴定了这一钙调蛋白结合位点与果蝇瞬时受体电位通道之间的相互作用,发现它们在钙离子依赖的条件下,可以形成亲和力非常强的稳定的蛋白复合物（解离常数在01～1微摩尔范围）。此外,通过合成多肽的方法,鉴定了果蝇瞬时受体电位通道913～939片段为该钙调蛋白结合位点的核心区域。最后,通过突变实验,进一步明确了果蝇瞬时受体电位通道922位的酪氨酸以及923位的缬氨酸为其钙调蛋白结合位点的关键氨基酸。总而言之,本研究发现和鉴定了果蝇瞬时受体电位通道上一个新的钙依赖的钙调蛋白结合位点,这一发现将为研究瞬时受体电位通道的体内功能提供生化基础,为阐明钙离子通过钙调蛋白调节瞬时受体电位通道的分子机制做出贡献。     

铝与钙调蛋白相互作用及其作用位点的研究

用500MHzNMR研究了铝与钙调蛋白的相互作用,主要研究了铝对钙调蛋白中芳香氨基酸残基(Tyr,His,Phe)构象变化的影响。实验结果表明,铝在钙饱和的钙调蛋白上存在着特异性的结合位点,结合位点数目至少为两个,第一结合位点可能位于钙调蛋白的N端结构域,第二结合位点靠近Ca~(2+)的Ⅲ结合域。Al~(3+)结合引起脱钙的钙调蛋白的构象变化不同于与Ca~(3+)结合引起的构象变化。Al~(3+)在CaM上的结合位点与Ca~(2+)的并不相同。柠檬酸等有机酸对铝的毒性有保护作用,这种保护作用是由于柠檬酸分子对铝的络合。     

多肽淀粉样沉积形成机制研究进展

淀粉样肽(amyloid peptide)是一类在一定条件下易于形成沉积的多肽或者蛋白质。这类多肽或者蛋白在一定的组织部位沉积引起的细胞毒性和细胞凋亡被认为是一些疾病的主要原因。尽管这类多肽在一级结构上没有明显的同源性,但它们形成的沉积具有共同的结构特征,即这些多肽形成了具有β片层结构的纤维状聚集体。淀粉样沉积的形成机制尚不清楚。研究认为,在沉积过程中,多肽分子首先形成寡聚体,然后转变为规则的β折叠结构,进而组装形成淀粉样纤维。很多因素有助于这一转变,如多肽序列、氨基酸残基间的相互作用,介质的疏水性、温度、pH以及金属离子的浓度等。对多肽淀粉样沉积形成机制的深入研究将为探索相关疾病病因和开发治疗药物提供极有价值的依据。     

牛NAD(+)异柠檬酸脱氢酶生物信息学分析

异柠檬酸脱氢酶(IDH)是三羧酸循环中的关键酶。为了进一步探索IDH的结构与功能,利用生物信息学方法对牛NAD(+)IDH进行分析。结果表明,该蛋白为亲水性蛋白,呈碱性,无跨膜区,在β亚基N端存在长度为16个氨基酸的信号肽,亚细胞定位在线粒体。二级结构预测结果显示该蛋白的三个亚基均以α螺旋为主,并且其上的螺旋和折叠均紧密有序排列,这有助于形成特定的结构域并发挥特定的生物学功能。对α和γ两个亚基采用同源建模法预测其三级结构模型,β亚基采用折叠识别法预测其三级结构模型,预测结果质量评估均较好。此外,分析了不同亚基的表面电荷分布,并预测了最可能的异柠檬酸和ADP的结合位点。通过生物信息学方法进行合理预测,为进一步研究IDH家族尤其是哺乳动物NAD(+)IDH提供了重要理论依据。