siRNA沉默ERp57对细胞中CRT表达与定位的影响

探讨ERp57基因表达沉默对人小细胞肺癌A549细胞中CRT表达和定位的影响。利用siRNA技术获得ERp57基因表达沉默的人A549肺癌细胞株,分析该细胞株中ERp57基因以及CRT基因的蛋白表达水平,免疫荧光法检测细胞中CRT的表达和亚细胞定位,荧光法检测细胞凋亡。成功获得ERp57基因表达沉默的人A549肺癌细胞株。在该细胞中,CRT表达上调但仍定位于内质网中。用米托蒽醌处理对照细胞14 h后,可使CRT大量转移到细胞膜表面并发生簇集,但在ERp57表达沉默的细胞中,CRT的膜转移和簇集现象不明显。细胞凋亡分析显示,米托蒽醌处理细胞48 h后,所有细胞均出现凋亡细胞典型细胞核固缩、分裂现象。试验证明抑制ERp57蛋白表达会增加A549肺癌细胞中CRT的含量,但同时也阻断蒽环类药物诱导的CRT膜转移,提示ERp57也是介导肿瘤细胞免疫原性凋亡的重要因子。     

重组人ERP57蛋白克隆和原核表达

目的：克隆人ERP57蛋白进行原核表达和纯化。方法：采用巢式RT-PCR从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人ERP57 cDNA,构建ERP57原核表达质粒（pET-28a/ERP57）并转化E.coli的BL21菌株。IPTG诱导蛋白表达,并在变性条件下经Ni-NTA树脂亲和层析纯化。分别用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果：成功获得大小为1518bp的人ERP57基因片段,转化菌诱导性表达61kDa的人ERP57蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功获得纯化的重组人ERP57蛋白,为后续ERP57蛋白功能研究奠定了基础。     

高表达精脒/精胺N1-乙酞基转移酶对人肺癌A549细胞株生长的影响

旨在研究人精脒/精胺N1-乙酰基转移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase,SSAT)高表达对人肺癌A549细胞生长的影响。以pCR2.1-SSAT质粒为模板,PCR法扩增人SSAT基因并克隆至pcDNA3.1表达载体。重组质粒转染A549细胞后,RT-PCR法和Western blotting法筛选SSAT高表达的细胞株。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。成功构建pcDNA3.1-SSAT重组质粒,用该质粒转染A549细胞后,筛选获得稳定高表达SSAT的细胞株。SSAT高表达导致细胞生长抑制,S期细胞减少和自发性凋亡细胞增多。结果显示,稳定高表达SSAT可在A549肺癌细胞中部分模拟多胺类似物类抗癌药物的药理活性,导致瘤细胞生长抑制和细胞凋亡。     

重组人钙网蛋白的克隆与原核表达

［摘要］目的: 克隆人钙网蛋白（calreticulin,CRT）并在E.coli中原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR 法从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA,构建CRT原核表达质粒（pET-15b/CRT）并转化E.coli 的Rossetta菌株。IPTG诱导后,表达蛋白在变性条件下经Ni-NTA 树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用SDS-PAGE和Western blotting法鉴定CRT表达和纯化状态。结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆,重组质粒pET-15b/CRT构建正确。转化pET-15b/CRT的E.coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白,该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法,该方法为后续的CRT蛋白功能研究奠定了基础。     

稳定表达外源性p16基因肺癌A549细胞株的建立及鉴定

为构建稳定表达外源性抑癌基因p16的肺癌A549细胞株,用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体（pcDNA3)。将抑癌基因p16转移入此基因缺失的人肺癌细胞株A549细胞中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞克隆,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫组织化学鉴定p16基因的表达,同时对克隆细胞分泌蛋白进行活性检测。结果显示转染p16基因的A549细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达,说明建立的p16真核表达载体能在肺肿瘤细胞中分泌表达蛋白,表达P16抑癌蛋白的A549细胞株的建立有助于研究抑癌基因p16在肺癌发生中的作用。     

CRISPR/Cas9技术介导的稳定沉默LDHA表达对肺癌A549细胞增殖的影响

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定沉默乳酸脱氢酶A(LDHA)的A549细胞系,并探讨LDHA沉默对细胞增殖能力的影响。方法:构建特异性靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA,转染A549细胞后经嘌呤霉素筛选获得LDHA沉默的稳定细胞株,并用定量PCR和免疫印迹实验分别检测LDHA m RNA和蛋白的沉默效率。利用MTT法检测A549细胞的增殖情况。结果:测序结果证实,CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA构建成功;筛选出LDHA沉默A549细胞株,定量PCR和免疫印迹实验证实LDHA m RNA和蛋白的表达量均明显下调。MTT法证实:培养24,48,72h后,LDHA沉默A549细胞与对照细胞相比,其增殖被抑制。结论:转染靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体,可明显下调LDHA m RNA和蛋白表达,抑制肺癌细胞A549的增殖。     

FKBP12真核表达载体的构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的:构建FK506结合蛋白12(FK506 binding proteins 12,FKBP12)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法:RT-PCR扩增人平滑肌细胞FKBP12基因片断,构建pcDNA3.1/Hygro(+)-FKBP12真核表达载体,经琼脂糖电泳、特异性内切酶切割及测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,HygromycinB筛选建立稳定转染的细胞株,免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果:构建了FKBP12真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达FKBP12蛋白。结论:FKBP12真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为深入研究基于FKBP12靶点药物的机制奠定基础,进而为探索安全、高效的免疫抑制剂提供新的途径。     

外源EGFP基因在肿瘤细胞中的稳定表达

通过将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因转染到人肺腺癌细胞（A549）内,建立以EGFP为探针的体外抗癌药物细胞株。使用电穿孔法导入EGFP基因到A549细胞;然后用G418筛选以及梯度稀释法筛选出EGFP高度表达的细胞株。初步建立稳定表达绿色荧光蛋白的人肺癌细胞株。     

EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞凋亡及CUGBP1蛋白表达的影响

目的：研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对炎性刺激的人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及与CUGBP1表达的关系。方法：MTT法检测EGCG和LPS刺激A549细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞内CUGBP1蛋白的表达。结果：与对照组相比,LPS体外显著促进A549细胞增殖,其胞核胞质内CUGBP1表达明显增强（P〈0.01）。加入EGCG可拮抗LPS促A549细胞增殖的作用,促进其凋亡,明显抑制LPS刺激的A549细胞内CUGBP1的表达（P〈0.01）。CUGBP1蛋白定量分析可知EGCG和LPS共同孵育A549细胞4h、24h时,细胞中的CUGBP1蛋白表达量较单纯LPS作用时降低。但EGCG和LPS共同孵育A549细胞24h,A549细胞中胞核CUGBP1蛋白表达量（1210.565±3.46）较4h时胞核CUGBP1蛋白表达量（67.344±3.68）高,差异有统计学意义（t=927.164,P〈0.001）。结论：EGCG可能通过干扰CUGBP1基因的表达抑制炎症刺激人肺腺癌细胞A549的增殖,促进其凋亡。     

EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞凋亡及CUGBP1蛋白表达的影响

目的:研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对炎性刺激的人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及与CUGBP1表达的关系。方法:MTT法检测EGCG和LPS刺激A549细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞内CUGBP1蛋白的表达。结果:与对照组相比,LPS体外显著促进A549细胞增殖,其胞核胞质内CUGBP1表达明显增强(P0.01)。加入EGCG可拮抗LPS促A549细胞增殖的作用,促进其凋亡,明显抑制LPS刺激的A549细胞内CUGBP1的表达(P0.01)。CUGBP1蛋白定量分析可知EGCG和LPS共同孵育A549细胞4h、24h时,细胞中的CUGBP1蛋白表达量较单纯LPS作用时降低。但EGCG和LPS共同孵育A549细胞24h,A549细胞中胞核CUGBP1蛋白表达量(1210.565±3.46)较4h时胞核CUGBP1蛋白表达量(67.344±3.68)高,差异有统计学意义(t=927.164,P0.001)。结论:EGCG可能通过干扰CUGBP1基因的表达抑制炎症刺激人肺腺癌细胞A549的增殖,促进其凋亡。