基于CRISPR/Cas技术的核酸检测研究进展

由成簇、规则间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR/Cas系统是广泛存在于多数细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可识别并结合外源入侵的核酸分子,之后Cas蛋白的切割活性被激活,能够对入侵的核酸分子进行切割使其降解。利用CRISPR/Cas系统特异的序列识别及切割活性,将其应用于核酸检测中,为提高检测灵敏度及特异性等性能指标提供了一种新思路。本文介绍了CRISPR/Cas系统的发展、作用机制等,对多样化的Cas蛋白在核酸检测中的代表性应用研究进行总结,进一步讨论了CRISPR/Cas技术应用于核酸检测中存在的优缺点,并对未来研究进行了展望,为基于CRISPR/Cas技术的核酸检测方法在病原微生物的检测中提供参考和依据。     

基于CRISPR的快速灵敏便捷分子检测

快速灵敏检测技术对疾病防控必不可少。特别是新冠疫情暴发以来,人们深刻认识到快速灵敏检测技术的重要性。近年来,以CRISPR/Cas为代表的基因编辑技术带来了生物技术革命性的进步。CRISPR的核酸检测技术因其快速、准确、灵敏、经济等特点,正在引发分子诊断革新,并已被成功应用于传染病、遗传病、肿瘤基因突变诊断,以及食品安全等领域。本文归纳了基于CRISPR的多种核酸检测体系及应用,并对未来CRISPR核酸检测发展趋势及结合人工智能的智能化检测进行了展望。     

CRISPR/Cas核酸检测技术的研究进展

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术作为强大的基因编辑及基因调控工具,在生命科学研究、生物技术产业、基因治疗等领域得到了广泛的发展与应用.近些年来,基于Cas蛋白(CRISPRassociated protein)特异性及非特异性的核酸切割活性, CRISPR技术在核酸检测领域展现了其简单快速、高效特异的特点,以及在即时检测(point-of-care testing, POCT)领域的应用潜能,可满足临床早期治疗及床旁监护所需的快速诊断需求.根据Cas酶的不同活性(顺式切割活性和反式切割活性),本文将基于Cas酶的核酸检测技术分为两大类,分别为CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12, Cas13, Cas14系统,并阐述了它们各自的工作原理.此外,本文还详细综述了CRISPR/Cas系统与多信号传感器的联合应用,总结了CRISPR/Cas核酸检测技术所存在的缺陷及面临的挑战,并对其未来的发展进行了展望.     

基于CRISPR/Cas系统的纸基分析在快速检测食源性致病菌中的应用

由食源性致病菌引起的食品安全事件严重影响人类健康,开发针对食源性致病菌的快速检测技术十分必要。成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）是原核生物的适应性免疫系统,具有特异性识别并切割核酸序列的功能。纸基分析方法作为一种简便性好、成本低廉的分析检测工具,在快速检测领域展现出良好的前景。因此,将CRISPR/Cas系统的高效识别能力和纸基分析方法的简便性相结合可实现对食源性致病菌的快速灵敏检测。本文简要介绍了CRISPR/Cas系统用于核酸检测的概况,对第二类单Cas效应蛋白系统的特点及原理进行概述,重点综述基于CRISPR/Cas系统的试纸分析、侧向流动分析和纸基微流控装置在检测食源性致病菌方面的应用,并讨论了CRISPR/Cas系统结合纸基分析建立检测方法的优势、当前的挑战及未来的发展前景。     

基于CRISPR/Cas系统的核酸生物传感器

近年来,CRISPR/Cas系统已经成为转录调控和基因组编辑的重要工具。除了在基因编辑领域的贡献,CRISPR/Cas系统独特的靶核酸顺式切割和非特异性单链核酸反式切割能力,在开发核酸检测的新型生物传感器方面展现出巨大潜力。构建基于CRISPR/Cas系统高灵敏度生物传感器的关键通常依赖其与不同信号扩增策略,诸如核酸扩增技术或特定信号转导方法的结合。基于此,本文旨在通过介绍不同类型的CRISPR/Cas系统,全面概述基于该系统的核酸检测生物传感器的研究进展,并重点对结合核酸扩增技术（PCR、LAMP、RCA、RPA和EXPAR）、灵敏的信号转导方法（电化学和表面增强拉曼光谱）和特殊结构设计生物传感的三大类型信号放大策略的CRISPR/Cas生物传感器进行总结和评论。最后,本文对目前的挑战以及未来的前景进行展望。     

基于CRISPR/Cas的分子诊断传感器在非核酸分子诊断中的应用

CRISPR/Cas不仅是一种重要的基因编辑工具,而且还是一种有效的分子诊断工具。目前基于CRISPR/Cas建立了一系列的分子诊断传感器系统,广泛应用于核酸、非核酸等检测过程中。与应用较广泛的核酸分子诊断传感器系统相比,基于CRISPR/Cas的非核酸检测系统目前尚未见系统性综述,因此本文围绕基于CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13建立的两大类非核酸分子传感器诊断系统的基本特征、工作流程及其检测原理等进行了全面综述,期望能为CRISPR/Cas分子诊断系统在体外诊断中的应用提供依据。     

CRISPR/Cas系统分类和病原体检测的研究进展

基于CRISPR/Cas系统识别和切割靶标DNA或RNA的特性不仅开发出精准、高效的基因编辑技术,也设计出革新的高灵活性和灵敏度的病原体检测技术。该文介绍并阐明CRISPR/Cas系统的不同作用机制和最新分类,着重综述“2”类CRISPR系统在诸多病原体检测中的研究进展,讨论分析了CRISPR/Cas系统在病原体检测领域存在的优点以及面临的挑战。     

CRISPR传感检测技术的研究进展

CRISPR传感检测技术具有便宜、简单、便携、高灵敏和高特异等优点,被称为“下一代分子诊断技术”。由于CRISPR-Cas系统具有特异的识别、顺式切割和非特异性的反式切割能力,已经实现了对DNA和RNA等核酸靶标以及蛋白质、外泌体、细胞和小分子等非核酸靶标的检测。为了解不同CRISPR传感检测技术的优势和发展历程,促进该技术的发展和应用,本文根据不同Cas蛋白的活性特征,对目前的CRISPR传感检测技术进行了分类总结,并在此基础上根据检测的靶标类型,依次总结了各种CRISPR传感检测技术的应用情况,以期为开发新型CRISPR传感检测技术提供参考。     

基于CRISPR/Cas系统的病原微生物检测体系构建研究进展

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)自发现以来,其应用范围在不断拓宽。除在基因编辑方面出色的应用能力外,近年来Cas12、Cas13等蛋白反式切割活性的发现,使其在病原微生物快速检测方面也显现出巨大的应用潜力。基于CRISPR/Cas系统建立的病原微生物检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,通过设计不同靶向的引导RNA能够对不同的目标进行快速检测,是一种极具应用潜力的检测技术。本文对基于CRISPR/Cas开发的部分代表性病原微生物检测技术类型进行总结。由于引导RNA在CRISPR/Cas系统中具有重要作用,但目前鲜见相关总结文章,本文对部分Cas蛋白引导RNA特点以及特异性靶标的获取也进行了重点阐述,以期为开发基于CRISPR/Cas系统新型病原微生物检测技术提供参考和依据。     

靶向RNA的CRISPR-Cas系统研究进展

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas(CRISPR associated proteins)系统是细菌和古细菌抵抗噬菌体、质粒等外源遗传物质的一种适应性免疫系统,该系统利用一种特殊的RNA(CRISPR RNA,crRNA)指导的内切酶来切割与crRNA相互补的外源遗传物质,从而阻碍外源核酸的侵染。根据效应复合物组成形式的不同,CRISPR-Cas系统分为1类(Ⅰ型、Ⅳ型和Ⅲ型)和2类(Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型)两大类。目前已发现多个CRISPR-Cas系统具有非常强的特异靶向RNA编辑能力,如Ⅵ型CRISPR-Cas13系统和Ⅲ型CRISPR-Cas7-11系统。随着研究的深入,相关系统在RNA编辑领域应用日渐广泛,使其成为基因编辑的有力工具。本文介绍了靶向RNA的CRISPR-Cas系统的组成、结构、分子机制以及其潜在应用,这为更好地研究该类系统的作用机制奠定基础,也为后期开发为稳定的基因编辑工具提供新的思路。     

基于CRISPR/Cas系统的生物传感策略研究进展

CRISPR/Cas9系统是继锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶之后的第三代基因组定点编辑工具,因其具有特异性切割双链DNA的能力,被广泛应用于基因编辑、生物传感等领域。Cas12a(Cpf1)、Cas13a(C2c2)等蛋白"附属切割"活性的发现,拓展了CRISPR/Cas系统在生物传感中的应用。近年来,研究人员开发出一系列快速、超敏、高特异性的生物传感系统用于分子检测,如SHERLOCK,DETECTR等。本文主要综述了基于CRISPR/Cas系统的生物传感策略的研究进展,并展望了其未来发展的方向。     

多重核酸检测技术研究进展

核酸检测技术因其快速、灵敏、特异、准确等优点,被广泛应用于细菌、真菌、病毒、寄生虫的快速检测和鉴定,以及疾病的早期筛查与诊断中。随着生物检测技术的发展,基于核酸的多重检测技术在核酸诊断领域发挥了越来越重要的作用,主要包括以多重PCR、核酸等温扩增、基因芯片为基础的多重核酸检测技术,这些技术可对多个靶标进行同时检测,具有快速、高通量、样品消耗少等特点。本文扼要介绍这些技术的原理,及其在病原检测、疾病诊断等方面的应用。     

CRISPR/Cas系统递送技术及其应用研究进展

基于CRISPR/Cas的基因编辑系统是近年来研究发展最重要的生物技术之一,其在基因编辑、核酸成像、转录调控、基因检测与疾病诊断、动物模型建立、农作物改良等领域均有十分广泛的应用.本文主要介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的背景与发展历程,梳理了包括纳米载体在内的各类递送技术,总结了该技术应用于疾病治疗的临床前和临床研究进展,简述了CRISPR/Cas在其他更广泛领域的应用,并就该技术面临的挑战、发展趋势和应用前景做了展望.     

可视化分析在病原体核酸现场快速检测中的研究进展

核酸检测因灵敏度高、特异性强而被广泛应用于病原体筛查与检测。随着检测需求的增加和扩增技术的发展，核酸检测方法逐渐向简单、快速、低成本方向发展。作为核酸检测“金标准”的实时荧光定量PCR法依赖昂贵的荧光读取设备和专业的操作人员，并不适用于病原体的现场快速检测。可视化检测方法无需依赖激发光源或复杂的设备，将可视化检测方法与快速、高效的扩增技术结合，能够以更直观、便携的方式呈现检测结果，具有即时检测(point-of-care testing,POCT)的潜力。本文对与扩增技术、CRISPR/Cas技术结合的可视化分析在病原体核酸快速检测中的应用及优缺点展开综述，以期为基于病原体核酸的POCT策略提供参考。     

基于CRISPR/Cas体系的生物传感器在病原体核酸检测方面的应用

成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas) 因高效的靶向结合和可编程性,已被开发为一种精准、高效、低价和高灵敏度的核酸检测工具。目前基于CRISPR-Cas体系的生物传感器在病原体核酸检测方面显示出了优良的性能,受到了人们的广泛关注,这种新型的病原体核酸检测有望替代传统的病原体检测方法。文中就基于CRISPR/Cas体系的生物传感器在病原体核酸检测中的最新研究进展进行综述。     

基于微流控芯片的等温扩增技术北大核心CSCD

基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的核酸扩增技术是分子诊断领域的金标准,然而PCR往往包含多个反应温度,涉及长时间的循环升降温过程,且需要在复杂热循环仪中完成,这些都限制了其在现场即时检测(point-of-care testing,POCT)中的应用。与传统PCR相比,等温扩增依靠恒定反应温度,反应时间短,检测装置简单,能够提供更加方便、快捷的核酸检测。基于微流控技术的等温扩增检测,通过兼顾微流控与等温扩增两者的优势,能够为POCT分子诊断提供更具竞争力的平台。例如,在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情防控中,多种形式的POCT等温扩增检测展示了其独特优势。文中首先归纳总结了典型的等温扩增技术及其检测方法,然后对不同类型的等温扩增微流控系统进行了分类总结与分析(如功能定位、结构组成、流体控制、系统特点等),最后总结了等温扩增微流控系统在新冠病毒(SARS-CoV-2)等不同病原体检测领域中的应用,并对等温扩增与CRISPR基因编辑等其他新型技术的相互结合进行了介绍与展望。     

细菌中CRISPR/Cas系统的应用和优化

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统在近年来得到越来越广泛的应用。相比传统的基因组编辑技术,CRISPR/Cas系统具有编辑效率高、特异性强、花费低、对实验技术要求低等优势。其中Ⅱ型和Ⅴ型CRISPR/Cas系统分别仅需要单个Cas9蛋白和单个Cpf1蛋白作为切割双链DNA的工具,因此特别受到研究者们的青睐。目前CRISPR/Cas9技术已成功应用于斑马鱼、小鼠、人类细胞等真核生物的基因组编辑中,并取得一系列重要成果,但在细菌领域进行的相关研究并不多。文中将简单描述CRISPR/Cas系统及其作用机制,重点介绍该系统的优化以及近年来其在细菌学领域所取得的进展。     

CRISPR在食源性致病菌进化分析、检测分型及毒力耐药调控中的应用进展

规律成簇间隔的短回文重复序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR) 与其相关蛋白基因系统可通过限制基因的水平转移而有效防御噬菌体等外源基因元件的入侵,不同细菌之间的CRISPR结构有所差异。基于CRISPR系统的差异性,文中对近几年CRISPR在食源性致病菌进化分析、检测与分型、毒力与耐药中的应用研究进行概述,并对基于CRISPR序列特点开发的细菌检测分型方法以及CRISPR与食源性致病菌的毒力、耐药性之间的相关性进行重点总结分析。此外,文中探讨了CRISPR在进化分析、检测与分型、毒力与耐药应用中的不足,提出将CRISPR分型方法标准化、完善与扩充致病菌CRISPR数据库、进一步探究噬菌体与细菌之间的共进化关系等建议,为进一步探索CRISPR功能提供参考。     

七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术的初步建立

由呼吸道病毒引起的疾病严重威胁着人类的生命健康，为了建立一种快速高通量的呼吸道病毒核酸检测方法，本研究将多重PCR技术同液相芯片技术结合起来，针对呼吸道合胞病毒A型和B型、乙型流感病毒Victoria系和Yamagata系、甲型流感病毒H1型和H3型以及新冠病毒等常见的七种呼吸道病毒，初步建立了七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术，评价了方法的特异性、敏感性和重复性，并使用来自安徽省疾控的25份临床急性期样本核酸对方法进行验证。结果显示，建立起的基于液相芯片多重核酸检测方法可特异性识别七种目标呼吸道病毒的靶基因序列，与包括副流感病毒在内的9种非目标呼吸道病毒无交叉反应。对七种病毒核酸进行十倍稀释液相检测，其中H3、BV、RSVB可以检出10²拷贝/μL,BY、RSVA和SARS-CoV-2可以检出10³拷贝/μL，对H1的检测限为10⁴拷贝/μL。25份样本核酸检测结果与实际相符。结果表明，本研究建立的七重呼吸道病毒液相芯片核酸检测技术具有特异性强、敏感性高、稳定性好等特点，可用于临床样本的快速检测，为呼吸道类传染病的液相...