nm23-H1基因转染前后人高转移大细胞肺癌细胞株双向凝胶电泳图谱分析

为了更全面地了解nm23-H1在肺癌中发挥转移抑制的机理,用双向凝胶电泳技术比较人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和转染nm23-H1基因的人大细胞肺癌细胞株(L9981-nm23-H1)间蛋白表达的差异.利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981)和转染nm23-H1基因的人大细胞肺癌细胞株(L9981-nm23-H1)的总蛋白,用图像分析软件比较分析以识别细胞间的差异表达蛋白质.结果成功地获得了两株细胞蛋白组分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳图谱.软件分析两种细胞的凝胶电泳图谱后发现,在相同分析条件下识别的蛋白质斑点数L9981为902±169个、L9981-nm23-H1为1160±212个.比较L9981和L9981-nm23-H1人大细胞肺癌细胞株的双向凝胶电泳蛋白质图谱后发现6个蛋白质点仅在L9981中有表达,17个蛋白质点仅在L9981-nm23-H1中有表达.此外,发现13个在两种细胞株中均存在,但表达量差异在2倍以上的蛋白质点(P<0.05).结果提示,nm23-H1基因转染引起人高转移大细胞肺癌细胞株蛋白质表达谱的变化,可能是其逆转肺癌侵袭转移的生物学基础.     

siRNA分析nm23-H1基因与人慢性髓性白血病的关系

设计并筛选靶向nm23-H1基因的siRNAs序列,探讨nm23-H1基因与人慢性髓性白血病之间的关系。依据siRNA设计原则,设计3条siRNA序列。将不同靶点的siRNA用lipofectamine2000转染人慢性髓性白血病细胞株K562。转染后24h RTPCR检测nm23-H1mRNA水平变化;转染后48h免疫细胞化学法检测nm23-H1蛋白表达。MTT法检测转染后24h、48h和72h有效siRNA对K562细胞生长的影响。3条siRNA中,siNM526能有效地抑制K562细胞nm23-H1基因表达,转染siNM526的K56细胞生长受到抑制。说明下调nm23-H1基因的表达有抑制K562细胞增殖的作用,即降低了K562细胞的恶性程度。nm23-H基因有可能成为白血病治疗潜在的分子靶点。     

铜绿假单胞杆菌QS相关基因差异表达的研究

选取100个与铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）群感效应（quorum-sensing,QS）相关的基因,克隆这些基因片段于pMD-18T载体,测序鉴定,点样制备cDNA基因芯片。制备cy3-dCTP／cy5-dCTP标记的探针,与芯片杂交。初步研究了处于不同生长期的铜绿假单胞杆菌基因的表达差异。指数中期和平台初期相比,有9个QS基因表达量最著增加,有6个基因表达量显著下降。利用芯片做针对铜绿菌假单胞杆菌药物的筛选：妥布霉素（Tobramycin）给药后细菌基因发生差异表达。证明了该cDNA芯片用于药物筛选的可行性。在国内首次研制开发了QS相关基因的cDNA芯片。应用基因芯片技术建立的铜绿假单胞杆菌QS相关基因研究平台,为找到能较好抑制铜绿假单胞杆菌正常生长的药物研究提出新的解决方法。     

nm23-H1对全反式维甲酸诱导的人肝癌细胞凋亡及其相关信号转导通路的影响

为了解nm23-H1转染对全反式维甲酸诱导的人肝癌H7721细胞凋亡的影响,本研究通过质粒转染把nm23-H1导入人肝癌7721细胞,建立了nm23-H1过表达稳转细胞株。首先采用MTT法测定细胞生长曲线,再通过流式细胞术和丫啶橙染色法观察细胞凋亡,最后采用Western blot检测凋亡相关的信号通路分子bcl-2、PKB、PKB-Ser473、PKB-Thr308和p53的表达情况。研究发现,nm23-H1转染对人肝癌7721细胞的生长没有影响;但nm23-H1转染能明显促进全反式维甲酸诱导的细胞凋亡,nm23-H1转染细胞凋亡率为18.2%,而对照细胞凋亡率仅为1.0%;nm23-H1和对照细胞的过量表达对bcl-2的表达没有明显影响,但PKB的Ser473和Thr308位的磷酸化显著下调,抑癌基因p53的表达量上调。研究结果表明,nm23-H1的过量表达增加了人肝癌细胞对全反式维甲酸诱导的凋亡的敏感性,因此推测nm23-H1可作为肝癌治疗的有效靶点。     

应用cDNA微阵列技术研究EB病毒LMP1介导的鼻咽癌中转移相关基因的表达

探讨EB病毒基因组编码的癌蛋白LMP1对鼻咽癌细胞中转移相关基因表达的影响.采用蛋白质印迹法检测在强力霉素(Dox)诱导下,鼻咽癌细胞系pTet-on-LMP1 HNE2(L7细胞)中LMP1表达的时效和量效关系.应用cDNA微阵列技术建立诱导性LMP1介导鼻咽癌细胞中转移相关基因差异表达谱;运用RT-PCR验证cDNA微阵列筛选差异基因表达的可靠性.与LMP1不表达的L7细胞比较,LMP1高表达的L7细胞中7个基因的表达显著上调,12个基因的表达显著下调.随机选择其中4个基因进行RT-PCR,结果显示,这些基因表达阳性,且与微阵列中的变化趋势一致.LMP1可能通过激活和/或抑制一些转移相关基因的表达而参与鼻咽癌转移过程.     

铜绿假单胞杆菌QS相关基因差异表达的研究*

选取100个与铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)群感效应(quorum-sens-ing,QS)相关的基因,克隆这些基因片段于pMD-18T载体,测序鉴定,点样制备cDNA基因芯片。制备cy3-dCTP/cy5-dCTP标记的探针,与芯片杂交。初步研究了处于不同生长期的铜绿假单胞杆菌基因的表达差异。指数中期和平台初期相比,有9个QS基因表达量显著增加,有6个基因表达量显著下降。利用芯片做针对铜绿菌假单胞杆菌药物的筛选妥布霉素(Tobramycin)给药后细菌基因发生     

应用基因表达谱芯片从不同转移能力的 乳腺癌细胞中筛选转移相关基因

人乳腺癌细胞系 MCF-7 及其转移亚克隆 LM-MCF-7 为肿瘤转移分子机制的研究提供了细胞模型 . 应用基因芯片技术比较两种具有不同转移能力细胞系基因表达谱的差异,寻找乳腺癌转移相关基因 . 提取两种细胞总 RNA ,分别用 Cy5-dCTP 、 Cy3-dCTP 标记 LM-MCF-7 和 MCF-7 的 cDNA ,并与含有 21 329 个基因的芯片进行杂交并扫描,利用 GenePix Pro 4.0 图像分析软件处理数据判断基因是否在两个细胞中存在表达差异 . 经互换荧光标记物重复两次实验,共筛选出差异表达基因 67 个,其中 41 个在 LM-MCF-7 细胞中表达上调, 26 个在 LM-MCF-7 细胞中表达下调 . 应用实时定量 RT-PCR 对 7 个表达差异明显的基因进行了验证 . 生物信息学分析结果提示,上述发现的差异基因编码产物与细胞内信号转导、转录调节、应激反应、新陈代谢、发育、细胞运动、细胞凋亡和细胞粘连等功能有关 . 据文献报道,这些差异表达的基因中有 35 个与肿瘤有关,其中 9 个与乳腺癌转移有关, 6 个可能参与肿瘤浸润和转移过程 . 根据基因芯片检测的结果,从功能上对 LM-MCF-7 细胞和 MCF-7 细胞与细胞凋亡的关系进行了研究,发现具有高转移倾向的 LM-MCF-7 细胞与 MCF-7 细胞相比,抗凋亡能力较强 . 上述与肿瘤转移相关基因在肿瘤转移中的作用及其分子机理有待深入研究 .     

乙肝相关性肝癌差异表达基因的获得及FOLR1分析

运用基因芯片技术获取以稳定转染HBx基因的肝癌细胞HepG2(HepG2-X)及非转染的肝癌细胞HepG2中差异表达的基因,并对其中一条基因进行的生物信息学分析。采用人肝癌G2细胞(HepG2)细胞系为对照组,以稳定转染HBx的HepG2细胞为实验组,抽取总RNA,经过反转录cDNA,对照组用Cy3实验组用Cy5荧光标记,获得cDNA探针;经杂交、洗涤后,通过ImaGene3.0软件进行分析统计。通过基因芯片筛选,获得643条与乙肝相关性肝细胞性癌相关的基因,其中FOLR1基因差异性表达最显著,HBx显著下调其表达,同源性比较分析结果表明,其碱基序列与已经报道的其他12种哺乳动物的相似率为67%-99%,且符合种属之间的进化关系。基因芯片筛选HBx诱导的HepG2差异表达基因具有样品用量少,高质量,高速度,高敏感等特性。FOLR1可能为HBV相关肝癌的发生、转移的诊断、靶基因治疗和预后评估提供一定的依据。     

cDNA表达文库转染NIH3T3-从高转移人肺腺癌细胞系Anip973中克隆新肿瘤转移相关基因

培养人高转移肺腺癌细胞系Anip973,构建其cDNA表达文库并转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,将经药物筛选后的转染细胞克隆消化为单细胞,接种到软琼脂中培养2周,根据细胞明显的形态学变化挑选出有意义的细胞克隆,扩增再培养,提取DNA,PCR扩增插入片段并进行测序分析。结果表明:软琼脂中挑选出克隆100多个,PCR测序后,得到3个已知基因包括人类核糖体蛋白L23、人类假定蛋白FLJ22104和人类丝氨酸蛋白酶抑制因子6亚型以及一些氨基末端截短的核酸序列。进一步的研究表明转染人类核糖体蛋白L23的细胞与转染空载体细胞相比具有较高的侵袭能力(P<0.02)。利用cDNA文库在NIH3T3细胞中的表达,随后筛查鉴定在软琼脂中发生形态学变化的细胞,是一种寻找恶性转化和癌转移相关基因的有效方法。人类核糖体蛋白L23基因在细胞的运动和转移中发挥重要作用。     

采用蛋白质组学技术筛选鼻咽癌细胞的甲基化沉默基因

为筛选鼻咽癌的甲基化沉默基因,采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2-dC)处理与未处理鼻咽癌细胞5-8F的蛋白质,PDquest图像分析软件识别差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.然后采用Western blotting和RT-PCR检测差异蛋白质nm23-H1在药物处理与未处理5.8F细胞中的表达水平,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测nm23-H1基因在药物处理与未处理5-8F细胞中的甲基化水平.建立了5-aza-2-dC处理与未处理5.8F细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了49个差异表达的蛋白质点,鉴定了33个差异表达的蛋白质,其中包括rim23.H1在内的15个蛋白质在5-aza-2-dC处理后的5-8F细胞中表达上调,而18个蛋白质表达下调.Western blotting和RT-PCR结果显示,nm23-H1在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后表达上调,MS-PCR结果显示,在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后nm23-H1基因甲基化水平下降,结果证实,nm23-H1基因是5-8F细胞中的甲基化沉默基因.15个5-aza.2-dC处理后表达上调的基因可能是5-8F细胞中的甲基化沉默基因,为筛选鼻咽癌甲基化失活基因提供了科学依据.     

nm23-H1基因缺失人肺癌细胞株的筛选与鉴定

nm23一Hj基因与肺癌的侵袭与转移密切相关,但是其作用的分子机制尚不清楚,为研究nm23—141基因的功能,筛选并鉴定了nm23一H,基因缺失人肺癌细胞株及其生物学特性．应用SoutheITIblot．RT—PCR和West—elTl blot检测9株人肺癌细胞株中nm23—14,基因的存在状态及其生物学行为．结果发现发现人大肺癌细胞株L9981中存在nm23—141等位基因的杂合性缺失,与其同源的NL9980及其它7株肺癌细胞株中nm23—111基因均以杂合子的形式存在;并且L998l细胞株的增殖能力、克隆形成能力、体外侵袭力．裸鼠体内成瘤性及移植瘤肺转移的能力均显著高于NL9980．研究结果显示nm23一H,基因的缺失可能与L998l细胞株恶性表型和高转移潜能密切相关．     

Alteration in gene expression profile and biological behavior in human lung cancer cell line NL9980 by nm23-H1 gene silencing

Lung cancer is the leading cause of cancer death in both men and women. Tumor metastasis is an essential aspect of lung cancer progression. nm23-H1 is a metastasis suppressor gene. The molecular mechanism by which nm23-H1 suppresses the metastasis is still unclear. Here, we compared the gene expression profile of human large cell lung cancer cell line NL9980 by nm23-H1 gene silencing with that of negative control cells to comprehensively investigate nm23-H1-mediated changes in gene expression of NL9980 cells. Microarray assay revealed that expression of 733-known genes (1.9%, 733/38,500) were altered in response to nm23-H1 gene silencing, including 466 upregulated genes and 267 downregulated. real-time PCR assay of the expression changes indicated that 81.82% (45/55) of verified genes were consistent with that observed in microarray assay. The upregulated genes included MMP-1, -2, SNAI2, CXCL1, 2, 3, PAI-2, while the downregulated genes included cystatin B, TIMP-2, E-cadherin, centrin-2, all of which have been associated with tumor metastasis. Furthermore, we confirmed by Western blot that the expression of MMP-1 and -2 were significantly increased while that of cystatin B was dramatically decreased in NL9980-nm23-H1 silencing cells. The NL9980-nm23-H1 silencing cells exhibited significantly more S phase growth and invasive ability. Thus, silencing of nm23-H1 gene caused metastasis-related gene expression changes in lung cancer cells. The knockdown of nm23-H1 expression may change the lung cancer cells to a more invasive phenotype through alteration in the expression of a set of genes.     

Down-regulation of N-acetylglucosaminyltransferase V by tumorigenesis- or metastasis-suppressor gene and its relation to metastatic potential of human hepatocarcinoma cells

The effects of transfection of the metastasis suppressor gene nm23-H1 and cell-cycle related tumor-suppressor gene p16 on the activity of N-acetylglucosaminyltransferase V (GnT-V) and their relations to cancer metastatic potential were investigated. After transfection of nm23-H1 into 7721 human hepatocarcinoma cells and A549 human lung cancer cells, the activities of GnT-V were decreased by 28%-42% in the cells. In contrast, when p16 was transfected into these two cell lines, the decrease of GnT-V activity was only observed in A549 cells. This was probably to be due to the obvious expression of p16 gene in parental 7721 cells and the deletion of p16 in A549 cells. The decrease of GnT-V mRNA was only observed in nm23-H1-transfected cells, but not in p16-transfected A549 cells, suggesting that these two genes regulated GnT-V via different mechanisms. Horseradish peroxidase (HRP)-lectin staining showed that the 7721 cells transfected with nm23-H1 or the A549 cells transfected with p16 displayed a decreased intensity with HRP-leucoagglutinating phytohemagglutinin and increased intensity with HRP-concanavalin A, indicating the decline of beta1,6 N-acetylglucosamine branching structure on the asparagine-linked glycans of cell-surface and intracellular glycoproteins. The nm23-H1 transfected 7721 cells also displayed some changes in metastasis-related phenotypes, including the increase in cell adhesion to fibronectin (Fn), the decline in cell adhesion to laminin (Ln), and the decreased cell migration and invasion through matrigel. Transfection of antisense GnT-V cDNA into 7721 cells resulted in a decrease of GnT-V activity, an increase of cell adhesion to Fn or Ln, and a decrease in cell migration and invasion through matrigel. These phenotypes bore similarity to those of the 7721 cells transfected with nm23-H1. Our findings indicate that the down-regulation of GnT-V by nm23-H1 contributes to the alterations in metastasis-related phenotypes, and is an important molecular mechanism of metastasis suppression mediated by nm23-H1.     

NALP1 基因与骨肉瘤细胞的相关研究

目的:探讨NALP1基因在骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的表达,以及高表达NALP1基因对于骨肉瘤细胞体外凋亡的影响。方法:使用RT-PCR、Western-blot法检测骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平并与人成骨细胞株hFOB1.19比较。将NALP1基因转染质粒PcDNA3.1,将重组质粒转染骨肉瘤细胞,分成高表达基因组、空质粒组及对照组,加入抗肿瘤药物顺铂及甲氨蝶呤促使肿瘤细胞凋亡,使用流式细胞仪测定各组肿瘤细胞凋亡率。结果:通过统计分析,骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的mRNA及蛋白表达水平均低于人成骨细胞株hFOB1.19(P<0.05),NALP1高表达组的肿瘤细胞凋亡率明显高于空白质粒组及对照组。结论:上调骨肉瘤细胞株MG-63、U-2OS中的NALP1的表达量可以促进肿瘤细胞凋亡。     

rab5a基因在肿瘤转移中的作用研究

为研究rab5a基因在肿瘤转移机制中的作用,将该基因稳定转染至低转移肺腺癌细胞系AGZY83-a中,采用Superarray肿瘤转移相关基因微芯片分析rab5a对肿瘤转移相关基因的表达影响,共获得了5个差异表达基因,rab5a基因促进s100a4的表达,同时抑制了nm23a、rac1、cst3、col4a2等基因的表达,并分别在RNA及蛋白水平进行验证,确认rab5a基因影响了肿瘤转移的多个途径,促进了肿瘤细胞转移能力增强。