铁钼辅因子

某些固氮生物(如棕色固氮菌)的变种,它们的固氮酶中铁蛋白有催化活性,但由于钼铁蛋白处于不活化状态,所以整个固氮酶不能显示出固氮活性,这种不能固氮的固氮酶可为从野生型固氮菌固氮酶钼铁蛋白中分离得到的物质(或因子)所活化或恢复固氮活性,此种活化因子叫钼铁辅因子。这种钼铁辅因子已从多种固氮生物中分离到,其分子量为1000～3000左右。按钼铁蛋白分子量为270,000计算,其中铝、铁、硫三种原     

有催化活性的固氮酶二聚态钼铁蛋白

利用离子交换层析和凝胶过滤,第一次成功地从棕色固氮菌提取液中分离出接近电泳纯的能重组固氮酶活性的二聚态钼铁蛋白。它的分子量约为150,000,每分子含钼约0.5原子。当与铁蛋白重组固氮酶时,表现出相当高的活性。这个结果对固氮酶底物络合中心的结构提供了重要的启示,指出与目前较为流行的双钼多核中心相比,含单钼的多核中心至少同样是不可忽视的可能结构。     

植物的共生固氮体系

氮是植物生命活动中不可缺少的重要元素之一。大气中的氮尽管为79％,但这种游离氮只有少数固氮细菌和蓝藻才能吸收利用,绿色植物却不能直接利用。这些细菌、蓝藻把大气中的游离氮固定转化为含氮化合物,成为植物所能吸收的氮,就称为生物固氮作用。固氮生物之所以能催化还原N2成NH3,是由于它含有固氮酶。固氮酶是一种结构复杂、功能特异的酶,由铁蛋白和钼铁蛋白组成。     

光在钼影响蓝藻固氮中的作用

我们过去的工作曾指出,蓝藻及其离体异形胞的固氮是一个依赖于光的过程,光对蓝藻固氮酶的合成和活性有调节作用。此外,多年的生化研究也已确定,钼是包括蓝藻在内的一切固氮生物生长和参与固氮酶催化活性中心结构的必需与关键性的金属元素,它对钼铁蛋白有调控功能。这样,     

蓝藻固氮酶钼铁蛋白的研究

改进了蓝藻固氮酶的分离、提纯方法。首次用小型厌氧聚丙烯酰胺凝胶制备电泳法,代替常用的层析法,获取了电泳纯的蓝藻固氮酶钼铁蛋白,简化了程序,缩短了实验周期。SDS凝胶电泳和分子筛凝胶过滤测定分子量结果表明,钼铁蛋白分子量为360,000,由4个分子量为90,000的同一类型亚单位构成。每个钼铁蛋白分子含1个钼,18个铁和3290个氨基酸残基。其中酸性氨基酸占优势。研究了柱孢鱼腥藻(Anabaena cylindrica)固氮酶粗提物和钼铁蛋白的某些特性,其结果是:米氏常数为3.33×10~(-3)大气压乙炔,等电点为5—5.5。紫外、可见光谱与其它固氮生物的类似。盐对蓝藻固氮酶较之对其它固氮生物的固氮酶有更大的抑制作用。     

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白两种聚合体的研究

 棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白八聚体相当于两个钼铁蛋白四聚体的聚合体。在细胞生长过程中,胞内钼铁蛋白两种聚合体的相对含量出现规律性变化:在对数期,细胞固氮酶比活力成上升趋势,而钼铁蛋白主要以高活力的四聚体形式存在;在对数期结束至稳定期,细胞固氮酶比活力下降至一个低水平的稳定值,此时的钼铁蛋白基本上为八聚体形态。在细胞固氮生长时,向培养基中加入过量氨可明显地导致钼铁蛋白由四聚体向八聚体的转化。我们推断,生长过程中胞内钼铁蛋白聚合态的变化可能是调节固氮酶活力的一种方式。胞外,钼铁蛋白的两种聚合态可以相互转化。     

不同底物与固氮酶及其钼铁蛋白相互作用的荧光光谱分析

 本文研究了不同底物(N_2,H_2,N_2O,NaN_3,C_2H_2)对棕色固氮菌固氮酶及其钼铁蛋白荧光光谱的影响。结果表明,上述底物均能络合在钼铁蛋白及固氮酶上,但络合程度不同,从而为固氮酶系统有多个不同的底物络合中心,底物络合中心在钼铁蛋白分子上,铁蛋白对钼铁蛋白有变构作用,提供了光谱学证据。     

钼铁蛋白铁钼辅因子的有机组分对其功能的影响

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶的钼铁蛋白经邻菲啰啉在厌氧或有氧环境中处理后,变为 P-cluster 单一缺失或 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的失活钼铁蛋白。含柠檬酸盐或高柠檬酸盐的重组液都使这两种失活蛋白能恢复固氮酶重组的 H~ 和 C_2H_2还原活性,活性恢复程度随反映钼铁蛋白中金属原子簇含量变化的圆二色和磁圆二色谱及金属含量的恢复程度的提高而提高,但它们固 N_2能力的恢复程度则不相同:P-cluster 单一缺失的蛋白用两种重组液重组后均可恢复其固 N_2能力,而 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的蛋白,只有用含高柠檬酸盐的重组液重组才恢复其固 N_2能力,表明含不同有机组分的重组液所组装的 P-cluster 均与天然状态相同,只有含高柠檬酸盐的重组液所组装的 FeMoco 才与天然状态相同,从而证明高柠檬酸盐是 FeMoco 的必需的有机组分。     

固氮酶的研究进展

固氮酶将N2还原为NH3的过程是自然界实现氮循环的重要环节。固氮酶是由γ2型二聚体组成的Fe蛋白和α2β2异四聚体组成的MoFe蛋白组成。固氮酶催化的机制包括铁蛋白的氧还循环和钼铁蛋白的氧还循环两部分。Klebsiella pneumoniae的nif基因簇由20个基因组成,构成了8个转录单位,总长度24206bp,其操控机制是多水平、多层次的调控过程。同时综述了固氮酶的多样性,目前已经发现的有钼铁固氮酶、钒铁固氮酶、铁铁固氮酶以及在Strpomyces thermoauophicus内存在的与已知的三种固氮酶体系明显不同的固氮体系。     

固氮蓝藻与棕色固氮菌固氮酶组分的交叉互补功能

本文报告了藻菌之间固氮酶组分的交叉互补试验。初步结果证明：固氮蓝藻(Anabaena azotica水生686)的钼铁蛋白与棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的铁蛋白之间存在着明显的互补功能。但这种蓝藻的铁蛋白在非细胞形态下很不稳定,易于失活。本实验为不同生理类型和不同进化程度的固氮生物之间固氮酶组分的交叉互补研究提供了新的资料。     

固氮蓝藻与棕色固氮菌固氮酶组分的交叉互补功能

本文报告了藻菌之间固氮酶组分的交叉互补试验。初步结果证明:固氮蓝藻(Anabacnaazotica水生686)的钼铁蛋白与棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的铁蛋白之间存在着明显的互补功能。但这种蓝藻的铁蛋白在非细胞形态下很不稳定,易于失活。本实验为不同生理类型和不同进化程度的固氮生物之间固氮酶组分的交叉互补研究提供了新的资料。       

固氮酶内部结构揭秘

固氮酶由钼铁蛋白和铁蛋白组成 ,钼铁蛋白包含ＦｅＭｏｃｏ和Ｐ Ｃｌｕｓｔｅｒ。为解释固氮机理 ,Ｋｉｍ等 ( 1 992 )、Ｐｅｔｅｒｓ等 ( 1 997)和Ｍａｙｅｒ等 ( 1 999)分别解析出分辨率为 2 8 、2 .0 和1 .6 的钼铁蛋白晶体结构。Ｅｉｎｓｌｅ等 ( 2 0 0 2 )又获得了 1 .1 6 的钼铁蛋白结晶 ,在对其进行结构解析后发现 :ＦｅＭｏｃｏ的内部有一个轻的原子与六个铁原子键连接。此轻原子不可能是硫 ,最可能是氮 ,但不排除是碳或氧的可能。已有极好的证据表明ＦｅＭｏｃｏ是固氮酶的底物结合位点和还原中心 ,但底物是如何结合到ＦｅＭｏｃ…     

在棕色固氮菌中诱导的硝酸还原酶和固氮酶相互关系的初步研究

0.1MNaNO₃ 可使棕色固氮菌诱导出硝酸还原酶,其粗提物的比活性为21．9 NO₂ 毫微克分子／分钟·毫克蛋白。在诱导硝酸还原酶过程中,诱导的粗提物中固氮酶活性比未诱导的下降更迅速。实验结果表明这是由于在诱导过程中固氮酶铁蛋白失活,而与钼铁蛋白无关。应用相同的方法对缺乏Fe.Mo辅因子的棕色固氮菌突变种Uw₄₅进行诱导,结果出现硝酸还原酶活性,证明硝酸还原酶和固氮酶钼铁蛋白不共享相同的含钼亚基。     

纯化柱胞鱼腥藻(Anabaena cylindrca)固氮酶组份(铁蛋白)的厌氧制备电泳法

各种固氮生物的固氮酶对氧都很敏感,无论是制备固氮酶的组份Ⅰ(钼铁蛋白)或组份Ⅱ(铁蛋白),也无论采取什么方法(如DEAE-纤维素层析法、硫酸鱼精朊沉淀法、胶滤、制备凝胶电泳等等)都必需在严格厌氧条件下进行,铁蛋白对氧更加敏感,因此要获得较纯而又具活力的铁蛋白,其分离、纯化过程既要严格厌氧又要迅速。到目前为止,仅红螺菌(Rhodospirillum rubrum)和棕色     

铁氰化钾氧化固氮酶钼铁蛋白与铁、钼、硫化合物重组的研究

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白经铁氰化钾氧化后变为“漂白蛋白”,其活性损失约75％,同时释放出80％的钼和50％左右的铁。与铁、钼、硫重组溶液重组,金属组成和乙炔还原活性均得到明显恢复。穆斯鲍尔(M／issbauer)谱表明,重组溶液中的Fe、Mo、S已形成FeMc6原于簇的类似物,“重组蛋白”的M6ssbauer谱和天然MoFe蛋白相似。     

固氮酶铁钼辅基在分离纯化中结构变化的新证据

根据Ｋｉｍ－Ｒｅｅｓ模型［１］,固氮酶铁钼辅基（即ＦｅＭｏｃｏ或Ｍ簇）,是由一个ＭｏＦｅ３Ｓ３簇和一个Ｆｅ４Ｓ３簇通过三个Ｓ－桥联接而成．然而,自Ｓｈａｈ等（１９７７）首次从结晶的钼铁蛋白中分离出具有生物重组活性的ＦｅＭｏｃｏ以来,固氮研究者们一直致...     

钨酸盐去阻遏的棕色固氮菌提取液中无机钼酸对固氮酶的活化

钨酸盐中培养并去阻遏的棕色固氮菌(W-Av)只有极微弱的固氮酶活性(0.3～0.5 nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白)。当以部分纯化的钼铁蛋白补入W-Av的提取液中,后者的固氮酶活性能够上百倍地提高。当有适量保险粉及ATP和ATP发生系统存在时,W-Av提取液与钼酸钠在30℃下保温,固氮酶得到活化。在本实验的最适条件下,固氮酶的活性可达5～8nmole C_2H_4/分/毫克W-Av蛋白或25～40n mole C_2H_4/分/n mole Mo。就固氮酶的活化来说,W-Av提取液是比较稳定的,在-15℃下冻存可维持二十天以上,60℃加热5分钟,总活性约降低一半。W-Av提取液与钼酸钠保温后在-15℃下保存四天,已活化的固氮酶活性也只比对照略为降低。钨酸盐抑制固氮酶的活化,但不抑制已活化的固氮酶活性。     

氧对固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu 62固氮酶活性的调节作用

本文研究了在好气条件下,在以谷氨酸为氮源的液体培养基中,固氮螺菌(Azospirllumbrasilense)Yu62固氮酶形成的条件及溶氧压对固氮酶活性的影响。厌氧使整体细胞固氮酶迅速失活;而见氧后固氮酶又重新恢复活性。Western blotting实验证实,这种可逆失活的分子基础,是由于固氮酶铁蛋白-亚基被修饰和去修饰。呼吸抑制剂KCN对固氮酶活性的抑制,亦是由于固氮酶铁蛋白被修饰。因此推论细胞内的能量状态可能是启动固氮酶活化酶系统的重要信号。谷氨酰胺合成酶的抑制剂MSX不能去除厌氧和KCN引起的抑制作用。结果表明：固氮酶活性的NH+4和厌氧关闭可能通过不同的机制起作用。     

高度缺失金属原子簇的钼铁蛋白的制备及其重组

棕色固氮菌固氮酶钼铁蛋白与邻菲罗啉厌氧保温时,尿素可使钼铁蛋白丢失的Ｆｅ原子数目显著增加,在有过量Ｎａ２Ｓ２Ｏ４存在时,每个蛋白分子失去的Ｆｅ原子数猛然增至２６－２８个,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５柱层析得到的蛋白已失去８５％的乙炔还原活性,而蛋白回收率仍可达６０％。与含Ｍｏ重组液重组后,这种失活蛋白的紫外－可见圆二色谱、凝胶电泳图谱和乙炔还少在性均有所恢复,结果表明,尿素可使厌氧钼铁蛋白的ＦｅＭ     

土壤杆菌固氮生理特性研究

对根癌土壤杆菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性研究结果表明,该菌具有自生固氮活性,其固氮活性的最适pH为8.0,温度为30℃.固氮活性在对数生长后期(14h)最高,延缓期和静止期乙炔还原活性较低.该菌株好氧,通过氧呼吸和吸氢酶的作用达到避氧固氮.当通入氧气超过呼吸耗氧时,对固氮活性产生抑制作用.在培养过程中增加NH_4~+浓度,固氮活性会降低,当达到15mmol/L时完全丧失固氮活性,表现NH_4~+阻遏固氮酶蛋白合成.在乙炔还原测定系统中加入NH_4~+并不影响乙炔还原反应,说明没有NH_4~+关闭现象.培养过程中加入MSX(2.5mg/ml)能解除10mmol/L NH_4~+对固氮酶合成的阻遏作用.固定的游离氮不能以NH_4~+形式分泌于胞外.固氮过程中放出大量氢气,培养16小时产氢量达65μmol H_2/mg蛋白.在限碳条件下(0.2%蔗糖)其吸氢酶活力可达520nmol H_2·ml~(-1)·h~(-1).