中国毛白杨根癌土壤杆菌的类型和对土壤杆菌素敏感性的研究

从我国北方8个毛白杨根癌病发病苗圃分离到根癌土壤杆菌(Agrobacterlum tume[actena)8株。经质粒型、生物型、寄主范匿和对土壤秆菌素agfocin 84和D286的敏感性测定,证明5株系nopaline质粒型,其中生物I型2株,生物|I型2株,I—II中间型1株,3株系agroplne质粒型,其中生物I型2株,生物II型1株。所有分离菌株均系宽寄主群,其中1株经回接能侵染单子叶植物美人蕉(Canna inaiea),水仙(Narcissus)和吊兰(Chlorophytum)。分离菌株中,5株nopaIine质粒型菌榫对土壤杆菌素84敏感,3株agropine质粒和3株生物I型nopali 质粒菌株对土壤杆菌素])286敏感。在温室中,合并使用两种土壤杆菌素产生菌——放射土壤杆菌(A．Radiobaccer)K84和D286的菌体悬浮液,预浸毛白杨和向目荚幼苗根部 或与致病的毛白杨根癌土壤杆菌共接种枝茎,降低根瘟病诱发率达94％以上。表明放射土壤扦菌K84和D286可以控制毛白杨根癌病。     

樱桃根癌土壤杆菌及其对土壤杆菌素84敏感性的研究

从山东、河北、辽宁等地樱桃园的樱桃冠瘿瘤和土壤样品中分离到46株根瘤土壤杆菌。经鉴定有4株是Agrobacteriumtumefaciens（原生物型1）,其余42株是A.rhizogenes（原生物型2）。这些菌株所诱导的冠瘿瘤中均合成胭脂碱（nopaline）,属胭脂碱型Ti质粒的根癌土壤杆菌,并对放射土壤杆菌K84菌株所产生的土壤杆菌素84敏感。由于K84菌株对含胭脂碱Ti质粒的根癌土壤杆菌有很好的抑制效果,因此,用K84菌株防治樱桃根癌病是有应用前景的．     

放射土壤杆菌HLB-2菌株抑制葡萄根癌土壤杆菌生长和冠瘿形成的研究

在山东莱西啤酒花冠瘿瘸发病严重地区,从啤酒花冠瘿中分离到一株无致病性的土壤杆菌,经鉴定为放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)HLB-2,属于生物I型。HLB-2菌株在培养基上产生一种类似土壤杆菌素84的物质,能抑制葡萄根癌土壤杆菌生物III型菌株的生长。在温室接种试验中,可以完全抑制16株致病力不同的葡萄根癌土壤杆菌中的14株菌(含octopine或nopaline质粒)在向日葵幼苗和葡萄幼枝上诱发冠瘿病。 在培养基上测定敏感性的结果和温室冠瘿病抑制试验的结果一致,表明HLB-2菌株的防病机制可能是由于它所产生的土壤杆菌素。在对比试验中,K84菌株和D286菌株对葡萄根癌土壤杆菌均无抑制作用。以上结果表明,HLB-2菌株在葡萄冠瘿病的生物防冶中有一定的实用价值。     

香港养殖海鲷弧菌致病菌药物敏感性及耐药质粒研究

从发病海鲷(Sparus sarba)中共分离到51株弧菌(\%Vibrio)\%,经API20E细菌快速鉴定系统及Alsina和Blanch关键生理生化特性分析鉴定为7个种,它们分别是：溶藻胶弧菌(\%V.alginolyticus)(24株),创伤弧菌(V.vulnificus)(12株)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)(7株),火神弧菌(V.logei)(4株),远洋弧菌Ⅱ菌(V.pelagius Ⅱ)(2株),河弧菌(V.fluvialis)(1株)和地中海弧菌(V.mediterranei)(1株)\%。其中3种优势菌溶藻胶弧菌创伤弧菌和副溶血弧菌证实对海鲷有致病性。另外采用平板稀释法检测了51株菌对16种抗菌素的敏感性。发现所有菌株对ceftriaxone,链霉素,萘啶酮酸和利福霉素敏感,几乎所有菌株对ceftazidime, netilimicin,氯霉素和sulfamethoxazole敏感.大部分菌株对氨苄青霉素 (60.8%),cefuroxime(667%),丁胺卡那霉素(55%),卡那霉素(588%)和三甲氧苄氨嘧啶(765%)等具有较强的耐药性。通过对菌株中所含有的耐药质粒进行分析,发现15株菌株含有1～4个质粒,分子量范围为9～123kb之间,对12株既含有较大分子量质粒又具有耐药性的菌株进行了质粒转化试验,结果其中9株菌的质粒具有转化能力,转化率为１０－１１～１０－９,表明所分离的菌株的抗药性是由于细菌染色体相关突变造成的。     

北京郊区根癌土壤杆菌生物型及质粒类型的鉴定

我们从北京郊区姚树、山挑树、梨树、毛白杨上采集到的26个冠瘿中,分离并鉴定出6株根癌土壤杆菌(Agrobacterium tunefaciens)。通过对向日葵、蕃茄幼苗、落地生根的致瘤试验;在乳糖培养基上3-酮基乳糖的生成;石蕊牛奶反应;碳源利用;在Clark和Ncw与Kerr两种选择性培养基上的生长以及对向日葵、烟草冠瘿组织中Opin类物质种类的鉴定,证明：一、从桃树冠瘿中分离的根癌土壤杆菌Pp 5、即一6两株和从梨树冠瘿中分到的Py 10菌株均属生物I型,质粒属N。Palinc类型;二、从山挑树冠瘿分到的剐一7菌株属生物r型,质粒为Oetpine类型;三、从北京东北旺毛白杨分到的Pt-12 菌株属生物l型,质粒为Agropine类型;四、从大兴县毛白杨冠瘿分到的另一菌株p．-2j属生物b—ll中间型,质粒为Nopaline类型。     

我国葡萄根癌土壤杆菌的生化型与质粒类型的初步研究

从我国内蒙古、辽宁、吉林、北京、山东等地采集的49份葡萄冠瘿标本中,分离到根痛土壤杆菌(Agrobacterium tumefactens)67株,经鉴定有生化1型21株,生化II型4株,生化III型42株。葡萄根癌土壤杆菌中以生化ill型占优势。生化111型有97％、生化I型有24％的菌株能使葡萄或向日葵致瘤。鉴定了2S株生化l型和生化[I]型菌株所致冠瘿中的opines,其中有2株生化III型菌株合成nopaline,3株生化III型菌株合成精氨酸,其余菌株合成octopine。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因无药物抗性标记突变株HBC-/GFP+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统 ,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先 ,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG ,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化 ,它的突变apxIICA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB03染色体上野生型apxIICA基因发生同源交换 ,两步法筛选获得了apxII基因突变株HBC^-GFP⁺,PCR和Southernblot对突变株进行初步鉴定 ,进一步对突变株的一些生物学特性 ,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明 ,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。该突变株的构建为进一步研究突变株作为载体和疫苗奠定了坚实的基础。     

苏芸金杆菌的质粒检测及载晶体蛋白合成基因的质粒在不同菌株间的传递

分析了苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)7个变种19个野生菌株及无晶体(sp+cr-)和无芽孢(sp-cr+)突变株的质粒图型,证实了苏芸金杆菌的质粒组成既有变种的特异性,亦有菌株的特异性。载有晶体蛋白质合成基因的质粒,B. thuringiensis var．Kurstaki HD-191 菌株可能为42和50Mdal,B．Thuringiensis var. aizawai HD-282菌株为47Mdal, B．Thuringiensis var．Israelensis IPS-82菌株为57Mdal的质粒,而B．Thuringiensis var. wuhanensis 140 菌株的此种基因则可能不在质粒上而在染色体中。HD-191载晶体蛋白合成基因的质粒以很高频率被传递给其无晶体突变株HD-1并在后者细胞中表达。B. thuringiensis var. israelensisIPS-82菌株和 B．Thuringiensis var. kurstaki 无晶体突变株HD—1之间载晶体蛋白合成基因质粒的传递未能成功,提示可能存在着不相容性的障碍。     

粘杆菌素高产菌株的选育

用亚硝基胍对多粘类芽胞杆菌 (Paenibacilluspolymyxa)AS1.541进行诱变 ,采用其自身次生代谢产物粘杆菌素进行筛选时正突变率为 32.3% ,获得一株粘杆菌素发酵单位比出发菌株提高 106%的菌株。对发酵单位最高的一株菌再次诱变 ,用甲硫氨酸结构类似物乙硫氨酸筛选时正突变率为 46.9%并得到一株产量提高 57%的菌株。     

我国部分地区土壤中的苏芸金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌

从云南、贵州、四川和陕西4省的土壤中分离到大量苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringie—nsis)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaeticus)菌株。血清型分析表明,苏芸金芽孢杆菌分离株分属于23个血清型中的13个血清型,另有近20％的自凝型菌株及部分与所有标准菌抗血清无反应的菌株。对该两种昆虫病原细菌的生态分布规律进行了分析。研究了全部苏芸金芽孢杆菌分离株对鳞翅目、鞘翅目及双翅目的6种昆虫的毒力特性、伴孢晶体与芽孢的形态,以及晶体蛋白质成分。观察和测定了球形芽孢杆菌分离株的形态和毒力,并分析了部分菌株的晶体蛋白质成分。得到22株高效苏芸金芽孢杆菌和2株高效球形芽孢杆菌。证明苏芸金芽孢杆菌是典型的土壤微生物类群,我国西南地区土壤中的苏芸金芽孢杆菌资源十分丰富。     

螺旋霉素聚酮合成酶基因和抗性基因的克隆与表达的研究

根据不同聚酮合成酶基因DNA的同源性,利用放线紫红素聚酮合成酶基因act Ⅰ,actⅢ作探针,从螺旋霉索产生菌Str．spiramyceticus U-1941基因文库中检测并分离了螺旋霉素聚酮合成酶基因pCN3H8。限制酶酶切分析表明,其分子量为44kb。通过分子杂交实验,将螺旋霉素聚酮缩合酶基因(与act Ⅰ有同源性)及聚酮氧化还原酶基因(与actⅢ有同源性)进行了定位。pCN3H8 DNA在麦迪霉素产生菌变株Str.mycarofaciens sub sp．68中的表达产物,经紫外光谱分析与麦迪霉素相似。pCN3H8在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株Str．coelicolor TKl7中的表达产物,不具有放线紫红素的色素,其纸层析谱型与螺旋霉素有显著差别。pCN3H8在变青链霉菌Str．lividans TK24中的表达产物,也具有抗菌活性。将pCN3H8 DNA转化对螺旋霉素敏感的Str.griseofuscus原生质体,获得了螺旋霉素抗性的表达。从转化子中分离得到了质粒DNA pSG3,其分子量为7．0kb,可能是pCN3H8DNA转化Str．grlseofuscus时在体内缺失而形成。再转化实验证明,宿主菌对螺旋霉索的抗性,确实是由于pSG3 DNA作用的结果。含质粒pCG4,pSG3的螺旋霉素产生菌Str．Ambofaciens转化子螺旋霉素的产率明显提高。     

我国葡萄根癌农杆菌Ti质粒的特征

以窄宿主葡萄农杆菌Ag162Ti质粒的T-DNA区tmr、tmsl和ocs基因座位以及T_A-DNA和T_B-DNA片段为探针,对12株我国分离的不同生物型、质粒类型和寄主范围的葡萄根癌农杆菌的引质粒转移DNA(T-DNA)进行Southern杂交分析。在9株生物3型octoplne Ti质粒菌株中,与上述探针均同源。其中窄宿主葡萄根癌农杆菌菌株杂交片段彼此较一致。广宿主葡萄根癌农杆菌菌株的杂交片段彼此差异较大。1株无致瘤能力的生物1型菌株与5个探针均不杂交。1株生物3型nopaline Ti质粒菌株及1株诱导冠瘿瘤中只合成精氨酸的菌株,杂交带的变化也大。由此可见葡萄农杆菌在生物进化过程中其转移DNA呈多态性,成为农杆菌中特殊类群。本分析对葡萄根癌农杆菌致病菌株的鉴定亦有帮助。     

苏云金杆菌辅助蛋白P20对杀虫晶体蛋白Cry1Ab表达的影响

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称Bt)杀虫晶体蛋白Cry1Ab因其C半端缺少了一段含4个半胱氨酸的氨基酸序列而导致蛋白的不稳定,报道苏云金杆菌辅助蛋白P20帮助Cry1Ab蛋白的表达及晶体的形成。利用穿梭载体pHT3101构建3个表达质粒,即pT1B、pP1B和pDP1B,3个质粒都含有cry1Ab基因,不同在于pT1B没有p20基因,pP1B含有p20全基因,而pDP1B不仅含有p20全基因,且在p20基因前插入cry1A?启动子。分别将这3个表达质粒经电转化到苏云金杆菌晶体缺陷型菌株CryB中,获得转化菌株T1B、P1B和DP1B。Western blot表明cry1Ab基因在这3株菌中均表达了130 kD的蛋白,部分降解为大约60 kD的蛋白。蛋白定量分析显示,3株菌130 kD蛋白量的比为1∶1.4∶1.5,降解后的60 kD蛋白量的 比为1∶1.1∶1.6,Cry1Ab蛋白总量的比为1∶1∶2∶1.6。镜检发现,Cry1Ab在3株菌中都形成典型的菱形晶体,其晶体大小为T1B Helicoverpa armigera）均具有明显的杀虫活性,三者的LC₅₀差异不显著。研究表明,P20对cry1Ab基因的表达和晶体形成均有帮助,P20表达量的多少可能是导致Cry1Ab蛋白最终产量有所不同的因素。     

苏芸金芽孢杆菌的一个新亚种

由北京近郊温泉地区油松林间土壤中,分离到一株产生伴孢内含物的芽孢杆菌TW 20。该菌株具有苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的典型特征,但无鞭毛抗原(H),伴孢内含物与孢子常常不分开,位于孢子囊一端由数个不同形状的晶体组成．其生化反应特性及酯酶型与已知23个血清型30个亚种的标准菌株均不相同。对油松毛虫(Dendrolimus tabulaef-ormis)、午毒蛾(Lymautria dispar)、黄褐天幕毛虫(Malacosoma neustria testcea)、光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)幼虫没有明显的致病性。根据上述特性,菌株TW20属于一个新的酯酶型亚种,定名为苏芸金芽孢杆菌温泉亚种——Bacillus thuringiensis subsp. Wequanen-sis。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β一半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GALl的穿梭表达质粒pYES2中,并把得到的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失90％以上的pep4-3突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β一半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β一半乳糖苷酶活水平不仅均要高于另一对照菌株,并且pep4-3突变菌株表现出受葡萄糖阻遏的严紧程度高及对诱导反应迅速等特点。此外,带有重组质粒的pep4-3突变菌株在葡萄糖阻遏培养基中最大生长量和重组对照菌株基本相同,但β一半乳糖苷酶在pep4-3突变菌株中的表达对细胞生长的影响明显小于对照菌株。     

杀蚊球形芽孢杆菌BS10的质粒限制图谱

本文报道一株国内分离的具有杀幼蚁活性的球形芽孢杆菌(Bacullus Sphaericus下文简称Bs)的大质粒(pFWl),其分子量为69．5×10⁶道尔顿,绘制了该质粒的xhol限制性核酸内切酶酶图。以苏云金芽孢杆菌以色列变种(Bacillus huringiensis israelensis下文简称BTI)75×10⁶道尔顿质粒为探针与泼菌株DNA进行核酸杂交,结果表明BTI与该菌株为毒素蛋白编码的基因序列之间无同源性,说明它们的进化来源是不相同的。     

四株糖单孢菌分离株的分类学研究

从广西地区的土样中,分离到4株细胞壁Ⅳ型,糖型A, 无枝菌酸的假诺卡氏菌科的放线菌菌株,编号分别为191、221、202、和212。根据4株 菌的形态学特征和细胞化学特征,将其归入糖单孢菌属。与该属5个已知种的7个代表株进行 的rDNA的BamHI酶切片段长度类型分析(Ribotyping)的结果表明：191为青绿色糖单孢菌(S.viridis),202为青灰色糖单孢菌(S.caesia),221和212为相同的与青绿色糖单孢菌(S .viridis)的亲缘关系最近的种,但不同于已知的任何一个种。     

原生质体融合技术选育耐热性β-淀粉酶产生菌

从土壤中分离到两株产β-淀粉酶芽孢杆菌菌株,经紫外线、丫-射线,氯化锂、亚硝基胍等诱变和筛选,得到β-淀粉酶高产菌和耐热性β-淀粉酶产生菌各一株。将两菌进行原生质体融合,获得兼有两亲株遗传特性的融合子wg6。从菌落形态和产酶特性等证实此融合子系两亲株融台所得的杂交子代。W96菌株产酶能力介于两亲株之间,酶的热稳定性较高,60℃处理15min,酶活力仍达93．2％。此菌株还可产生少量茁霉多糖酶(一种支链淀粉酶)．与所产生的β-淀粉酶协同作用,使淀粉水解率达到80．6％,因而有较高的应用价值。     

苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达

用改进的碱解法分析基因供体菌苏云金芽孢杆菌蜡螟变种81-6(Bacillus thuringiensis var.galleriae 81-6)株有两种小质粒和一种大质粒。 将碱解法抽提到的质粒用Pstl完全酶解,与同样用PstI完全酶解的载体质粒pcAMPUC连接,以此重组质粒转化苏云金杆菌无晶体蛋白突变株 Bacillus thuringiensis var,kurstaki HD-1 Cry—B株的原生质体。用ELlSA法筛选到一株阳性转化菌落,分析了其质粒组成和插入片段的大小。毒性试验显示阳性转化子对昆虫幼虫有毒杀作用。     

利用淀粉的碱性蛋白酶工程菌的培养条件

自70年代开始,国内曾筛选出短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 289、209两株产碱性蛋白酶的菌株。由于这两个菌株以葡萄糖为速效碳源,菌株产碱性蛋白酶的能力受培养基中总糖的制约,且两株菌易受短小芽孢杆菌烈性噬菌体PP_1—PP_10。的感染,因而不利于作为碱性蛋白酶制剂生产用菌。作者已从制革厂毛泥池中分离得到一株碱性蛋白酶产生菌——短小芽孢杆菌cl72,该菌株对PP_1—pp_10。噬菌体不敏感,对地衣芽孢杆菌pL_1噬菌体亦无交叉感染,是野生型的噬菌体抗性菌株。C172菌无淀粉酶基因,仍