流行性感冒病毒重组的研究III．一株温度敏感活疫苗株的选育及其反应性、免疫原性和流行病学效果

用福R3 LS 母株与紫外线照射灭活的京科74-5重组后,选育出京福R8-l ts 株,经备项实验室检查,反应性与免疫性观察以及流行病学效果观察,证明是安全有效的,其遗传性足稳定的,经过人体再分离的病毒未出现返祖现象。采用重组选育的方法,可大大缩短活设苗毒种选育的时间。本文并对选择野毒的标准及与京福R8-lts株的流行病学效果有关问题进行了讨论。     

甲/福流/8/58(H2N2)血凝素基因对该病毒在地鼠鼻甲中繁殖性状的影响

用在地鼠鼻甲繁殖不好、但在肺中繁殖较好的甲/福流/8/58(H2N2)流感病毒,与在地鼠的上下呼吸道均能较好地繁殖的H3N2型病毒重组,所获重组株(福R3),除HA基因是来自H2N2外,其它基因均来自H3N2。该重组病毒像亲本株H2N2株一样,在地鼠鼻甲繁不好。结果表明,编码甲/福流/8/58病毒的H2血凝素的基因影响着地鼠的组织嗜性。     

流行性感冒病毒重组的研究I．高产株和表面抗原重组株的选育

本文报告了甲型流感病毒重组高产株、血凝素单价抗原重组株及神经氨酸酶单价抗原重组株的选育和鉴定方法。实验证明利用灭活病毒和活病毒两株亲本株混合感染,在鸡胚系统中重组,经过抗血清中和选择,再经终末纯化,可以简便、快速而又准确地获得重组株。     

流行性感冒病毒重组的研究——Ⅰ.高产株和表面抗原重组株的选育

本文报告了甲型流感病毒重组高产株、血凝素单价抗原重组株及神经氨酸酶单价抗原重组株的选育和鉴定方法。实验证明利用灭活病毒和活病毒两株亲本株混合感染,在鸡胚系统中重组,经过抗血清中和选择,再经终末纯化,可以简便、快速而又准确地获得重组株。     

流行性感冒病毒重组株京生75-29 R2 T1及冷适应株31-广的基因分析

用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析了流行性感冒病毒重组株京生75-29R2 T1(H3N2)及冷适应株31-广(H3N2)的RNA及多肽。重组株京生75-29R2 T1的HA及M基因系来自流行病毒亲本株/甲/北京/29/75(H3N2),而P_2、NA、NP及NS基因则来自温度敏感母株福R3(H2N2)。流行病毒株甲/穗/03/68(H3N2)在低温条件下经鸡胚尿囊腔传递24代而获得的冷适应疫苗毒株31-广(H3N2)其基因型与野毒株一致。     

甲型流行性感冒病毒自然温度敏感株基因损害定位

采用重组试验和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术,把晚期甲3型流感病毒自然ts突变株齐防79-39的ts损害定位在膜蛋白(M)基因上。但互补试验表明,齐防79-39与M基因损害的WSN标准株ts51可以发生互补,这是基因内互补的一个证据。PAGE技术证实,新甲1型流感病毒自然ts株津防77-78的M基因上确有损害。互补试验证明齐防79-39属于一个互补组,而津防77-78与ts51同属于另一个互补组。 本文结果还表明,晚期甲3型齐防79-39的ts损害基因可能是由甲3型野毒株自发突变所产生,而并非通过在自然界与新甲1型重组而获得。     

G145R突变后乙型肝炎病毒表面抗原在酵母系统的表达及其免疫学特性分析

为了研究乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)发生G145R突变后的免疫学特性改变情况,首先利用Pichia pastoris酵母表达系统分泌表达G145R突变后的HBsAg的preS2 S(中蛋白),用重组表达产物免疫小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot实验等研究其抗原性和免疫原性与野毒型HBsAg的异同。从150个阳性表达克隆中筛选出一株表达量最高的克隆株MC23,Western blot检测显示,表达的HBsAg中蛋白单体主带分子量在34kD、37kD左右,表达量约为200μg／L。用不同的HBsAg检测试剂检测其抗原性发现,G145R突变后的HBsAg,用绝大多数试剂都不能很好地检出,检出能力只有野毒型HBsAg的50％或更低,但用美国雅培公司的试剂检出能力可达野毒的98％。G145R突变后的HBsAg中蛋白免疫小鼠后,血清中可检测到1：1600的特异性表面抗体,该抗体与G145R突变后的HBsAg“a”决定簇合成肽P2—145R也能发生交叉反应,反应滴度为1：80。但该抗体和野毒型HBsAg蛋白以及野毒“a”决定簇合成肽P1-wt均不反应。上述结果表明,G145R突变后的HBsAg中蛋白在Pichia pastoris酵母系统得到了分泌表达,表达产物仍具有较好的免疫原性,但和野毒HBsAg相比,其抗原性和免疫原性发生了明显改变。     

甲3型流行性感冒病毒血凝素的pH特征

本文报告,pH9.6碳酸缓冲液对甲3型流感病毒的血凝滴度有明显降低作用,对甲1型和乙型仅有轻微影响,对甲2型的影响则介于两者之间。用不同pH的碳酸缓冲液、磷酸缓冲液及盐水等,测定甲3型流感病毒的血凝滴度,结果表明高pH对其有明显影响。分别具有甲3、甲2或甲1血凝素的重组株,在pH9.6碳酸缓冲液中,其血凝素的稳定性也和上述结果一样,即具有甲3血凝素的重组株,其血凝素对pH9.6碳酸缓冲液最敏感;甲1重组株的血凝素较稳定:而具有甲2血凝素的重组株则介于两者之间。利用此pH特征测定新分离的经血凝抑制试验鉴定为甲3型和乙型流感病毒,得到同样结果,因此有可能利用此pH特征对新分离的甲3型流感病毒进行初步鉴定。     

小鼠对重组痘苗病毒表达流感病毒血凝素的免疫反应

实验比较了小鼠对表达流感病毒A/NJ/11/76(H1N1)和A/Jap/305/57(H2N2)血凝素基因的痘苗病毒重组株HSW2和VInf1的免疫反应,两株重组病毒经静脉或静脉加鼻腔免疫小鼠后都产生相应血凝抑制抗体;用不同剂量的痘苗病毒重组株HSW2皮内接种家兔也产生相应抗体,且抗体滴度与接种的病毒量成正比关系,但用痘苗病毒野毒株免疫的家兔未测到抗体,这两株痘苗病毒重组株免疫的小鼠,能保护小鼠对流感病毒母株的攻击,HSW2和VInf1的保护指数分别为3.3和3.9个对数,但这两株病毒未能诱导细胞毒性T细胞反应。     

用单克隆抗体选择具有潜在流行病学意义的A/曼谷79—1流感病毒变异株

用甲3型流感病毒A/曼谷79-1血凝素特异的单克隆抗体,对我国从1979—1984年分离的45株H3N2病毒进行了抗原分析,并与用单克隆抗体选择的51株A/曼谷79-1变异株作了比较。发现后者同1979年以来我国流行的H3N2流感主流株高度相似。这证明,用单克隆抗体可选出有流行潜力的变异株。本文就通过单克隆抗体选择、提前获得甲型流感亚型内变种的可能性进行了讨论。     

柔嫩艾美耳球虫早熟系的选育及其生物学特性研究

选育制备弱毒疫苗所需的柔嫩艾美耳球虫早熟系并对其生物学特性进行研究。运用Jeffers建立的早熟系选育方法对柔嫩艾美耳球虫山西株（E．tenella SX010323）进行早熟选育,并对其内生发育、致病性、繁殖力、免疫原性、稳定性进行观察和检测。结果表明：经过海兰白雏鸡15次传代之后,E．tenella SX010323潜隐期由141h缩短至120h,卵囊明显缩小。选育得到的柔嫩艾美耳球虫山西株早熟系（E．tenella SX010323P15）其内生发育表现第二代裂殖生殖不完全;亲本株与早熟系对11日龄雏鸡的半数致死量分别为7．52×10^4个／只、27．64×10^4个／只,早熟系在致病性与繁殖力上均较母株大幅度降低,但保留了母株的免疫原性,经早熟系免疫的雏鸡可抵抗亲本株半数致死量的攻击。对选育的早熟系进行放松选择传代10次,其潜隐期、OPG、致病性均保持了早熟系的特征。提示通过早熟选育得到了遗传相对稳定的柔嫩艾美耳球虫早熟系。     

表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

在克隆和鉴定新城疫病毒（NDV）F48E8株血凝素－神经氨酸酶（HN）基因的基础上,应用分子克隆技术将HN基因导入鸡痘病毒插入载体pFG1175－1中启动子P7．5的下游,得到携带NDV-HN基因的质粒pFGHN1175－1。将此质粒pFGHN1175－1以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株282E4株感染3～4h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化3次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用NDV—HN基因特异性探针进行斑点杂交试验以及用HN基因特异性引物作PCR检测,表明NDV—HN基因已插入鸡痘病毒基因组中。以NDV－HN蛋白特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,证实重组鸡痘病毒在感染细胞中表达了HN糖蛋白,从而成功建立了表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒。     

新城疫病毒HN基因的遗传变异与HI相关性的研究

选取国内1999~2004年分离的新城疫野毒10株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,对其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因分别进行克隆和测序,结合在GenBank中发表的LaSota、F48E9和Clone30等参考序列,对其氨基酸序列进行遗传变异分析,绘制系统发育树。利用SPF鸡在隔离器中分别制备上述NDV毒株的单因子阳性血清,进行血凝抑制(HI)交叉试验,计算NDV不同株之间的HI相关系数(r)。利用统计学软件SPSS8.0对NDV不同株之间的HN氨基酸同源率和HI相关系数(r)进行相关比较。结果表明:NDV野毒间氨基酸高度同源,同源性为96.5%~99.8%,而与LaSota、F48E9和Clone30同源率仅为87.4%~89.9%;所有野毒均缺乏1个潜在的糖基化位点;HN基因的氨基酸同源性与HI相关系数显著相关(P<0.01,r=0.55)。     

表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

表达猪圆环病毒II型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

摘要:【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小 鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

麻疹病毒L4株血凝素基因的克隆与表达及免疫原性

从部分减毒的麻疹病毒Ｌ４株感染的Ｖｅｒｏ细胞中提取ｍＲＮＡ,进行逆转录及ＰＣＲ扩增,克隆到了长１．９ｋｂ的４个血凝素基因克隆,ＤＮＡ序列分析发现,Ｌ４株的血凝素甘因有４个碱基与Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株不一致。造成了３个氨基酸差异,这４个克隆在重组痘苗中的表达后,３个克隆的表达产物均表现出良好的血凝活性,助融合活性（Ｆｕｓｉｏｎｈｅｌｐｅｒ）和较强的免疫原性,表达血凝素分子量分别为未糖化的６８ｋＤ以及糖     

口蹄疫病毒和猪肠道病毒基因重组获得的c731重组株的进一步研究

对不同属间小RNA病毒基因重组株c731,进行了病毒与细胞亲和力、毒蛋白的PAGE,病毒的乳鼠毒力和免疫原性试验,进一步证实,c731是口蹄疫病毒和猪肠道病毒通过基因重组产生的新病毒株。     

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株基因特征及其神经毒力的初步观察

中国脊髓灰质炎病毒疫苗株普遍存在基因变异的现象,如重组,点突变等。我们选出１０株有代表性的变异株,在具有人脊灰病毒受体基因的转基因小鼠ＰＶＲ－Ｔｇ２１中做毒力分析,发现Ｓａｂｉｎ １基因型与野毒基因型的重组株显示很强的神经毒力,其ＰＤ５０ｉｎＴＣＩＤ５０值为４．５,而Ｓｂｉｎ１标准株的ＰＤ５０值大于８０。另外两株Ｉ型疫苗株只有关键性核苷酸位点发生突变,只在位点５２５－发生突变的一株,其ＰＤ５０值为     

共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性

【目的】研制猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二联活疫苗,并用猪IL-18作为免疫佐剂。【方法】将猪IL-18基因插入到质粒p GO中,获得的重组转移质粒p GO18与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染ST细胞,并进行空斑筛选和纯化;RT-PCR和Western blot分别从转录和蛋白水平鉴定其表达情况。将重组病毒PGO18和PGO、PRV弱毒株HB98、PCV2灭活商品苗和1640细胞培养基分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后二次免疫,二免后4周用PCV2 DF强毒和PRV Min/A强毒接种小鼠。通过ELISA、血清中和试验和流式细胞术及攻毒保护试验评价重组病毒的免疫原性。【结果】获得了重组病毒PGO18,并且可在ST细胞内表达;PGO18可诱导小鼠机体产生PCV2的ELISA和PRV的中和抗体水平,刺激CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的增殖,且能有效抵抗PCV2和PRV强毒攻击。【结论】IL-18基因可增强重组病毒的免疫效果,使重组病毒具有良好的免疫原性,有望成为防治PCV2和PRV的候选疫苗株。     

通用流感疫苗研究进展

流感是一种对人类危害极大的传染病,接种疫苗被认为是预防流感的最有效手段。目前所用的流感疫苗主要是根据现行流行株的减毒或灭活病毒疫苗及基于流感血凝素和神经氨酸酶设计的重组蛋白质疫苗。但流感病毒变异大,易逃逸机体免疫监视,有效的疫苗须不断分离新流行株和不断更新疫苗免疫原。为解决这一问题,很多科学家一直在研究基于病毒高度保守性蛋白质、能够预防所有流感病毒毒株、可诱导持久保护性免疫的通用流感疫苗。我们对基于基质蛋白M2、核蛋白等的通用流感疫苗做一简要综述。