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孙连魁 《生物化学与生物物理进展》1985,(4)
限制性核酸内切酶不仅是分析和操纵DNA序列的工具,而且也为研究DNA-蛋白质之间相互作用提供了一条可行的途径。核酸内切酶如何识别、结合、切割DNA,不少文章已有报道。至今没有解决的一个问题是:同一DNA分子上具有相同核苷酸顺序的不同限制位,为什么能以不同的速度为同一种内切酶切割。为了研究这个问题,我们选择P_2噬菌体DNA和EcoRI内切酶作为试验系统,用酶促反应的动力学和热力学方法研究其切割机制,所得资料表明,不同限制位点的切割速度 相似文献
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本文选择限制性核酸内切酶BglⅠ和pBR322-DNA为试验系统,用酶促反应的动力学和热力学方法来研究内切酶对环状DNA分子的专一性和非专一性结合及切割过程,求得了各限制位点的切割速度k及活化能E,各限制位点催化速度常数k_c,酶同限制位点专一性结合的平衡常数k_S非专一性结合的平衡常数k_N及其热力学参数△H,△S。研究表明:不论底物的构型如何(线状还是环状),内切酶都以相似的动力学和热力过程对其进行结合与切割。 相似文献
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限制性内切酶及其它DNA与RNA修饰酶是分子克隆技术的基本工具。1限制性内切醉和DNA甲基化酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性内切酶识别序列的特定的DNA序列或附近的序列,并在此切割DNA双链。它可以分成3类:Ⅰ类和Ⅲ类在同一蛋白分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制(切割)活性。Ⅰ类酶结合于识别序列,但随机切割DNA;Ⅲ类酶能在识别序列位点切割DNA。在分子克隆中1类和皿类酶都不常用。D类限制一修饰系统限制性内切醇和修饰(甲基化)酶不在同一蛋白分子中,限制性内切酶能专一地切割识别序列,并不依… 相似文献
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(一)DNA分离、解析、合成技术的开发研究 1.限制性内切酶开发研究.解析该酶的性质和作用条件,探讨在细胞内切割异种DNA的效率. 2.提高DNA碱基配对解析的精度,探讨碱基配对的遗传语言和探索生产有用物质的功能. 相似文献
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郑文尧 《生物化学与生物物理进展》1985,12(5):64-66
限制性内切酶Sau3AI是分子生物学与遗传工程研究的重要工具酶之一。它能确定DNA复制的起点或终点的位置,确定RNA在DNA上的转录位置,分析DNA中脱氧核苷酸序列的排列以及基因的分离等。 J.s.Sassenbach等人首先从Staphylococcus aureus 3A(1)中提取限制性内切酶Sau3AI,其切割序列为:它除了对腺嘌呤的甲基化作用不敏感之外,是MboI的异源同功酶。我们参考J.s.Sussenbach等人的方法,并 相似文献
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文成君 《中国生物化学与分子生物学报》2002,18(4):433-439
对 6株成团肠杆菌 (Enterobacteragglomerans)接合子的分子生物学进行了分析 .6株菌与nifHDK基因有杂交 .菌株总DNA经BamHⅠ酶切后与pEA9 DNA进行Southern杂交 ,只有 2株菌具有完整的质粒DNA ,其余菌株质粒DNA发生了 15 3~ 137 7kb不同程度的缺失 .用切割位点较少的限制性内切酶XbaⅠ酶切 6株菌的总DNA ,经脉冲场凝胶电泳 (PFGE)后用pEA9 DNA为探针进行Southern杂交 ,每株菌的pEA9 DNA明显大于用BamHⅠ酶切后的杂交结果 ,表明质粒与染色体发生了整合 .转座子Tn5或插入序列IS 12 2 2和IS 12 71可能参与质粒与染色体的整合过程 . 相似文献
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利用分子信标被切割后荧光信号的变化.发展了一种简便的检测限制性内切酶活性的新型荧光分析方法.以限制性内切酶Xsp I为例.将其识别位点嵌入具有茎环结构的分子信标探针(Molecular Beacon,MB)的环状部分,利用这种分子信标在溶液中形成的瞬时二聚体结构,实现了限制性内切酶对分子信标的切割.在优化的条件下,反应初速度与酶的浓度成正比,线性范围为0.05~50 U/mL,检测限为0.05 U/mL.通过改变分子信标环部的识别位点的序列.还可以检测其他限制性内切酶如Alu I的活性. 相似文献
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《中国细胞生物学学报》2016,(4)
当前,CRISPR/Cas9系统靶向痘苗病毒的相关研究鲜有报道。该文采用了CRISPR/Cas9基因组定点编辑技术,以痘病毒为研究对象。在重组痘病毒WR-EGFP中针对EGFP基因序列设计不同靶点g RNAs,转染Cas9/g RNA质粒,同时感染WR-EGFP痘病毒,随后观察EGFP荧光表达、提取病毒基因组,通过PCR进行切口鉴定并运用错配酶切法验证CRISPR/Cas9对痘病毒靶点DNA切割的切口修复情况。与单独感染WR-EGFP组相比,转染了Cas9/g RNA174和Cas9/g RNA175质粒的EGFP荧光强度明显降低,表明CRISPR/Cas9抑制WR-EGFP病毒中EGFP基因的表达。相对定量PCR及错配酶切实验结果显示,CRISPR/Cas9切割靶点导致WR-EGFP病毒基因组产生了切口,并且存在DNA错配修复现象。最后,通过结晶紫染色法测定痘病毒的滴度,结果显示,经CRISPR/Cas9处理组的痘病毒滴度显著下降,即CRISPR/Cas9能够使痘病毒的复制能力显著地降低。综上所述,CRISPR/Cas9切割痘病毒基因组DNA并且抑制痘病毒复制。 相似文献
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限制性内切核酸酶的切割识别序列分为回纹对称和非回纹对称结构两类,由于DNA是互补双链, 所以对于识别序列为回纹对称结构的限制酶,其识别序列在DNA的两条链上是一致的, 可以写为一个, 但对于识别序列为非回纹对称结构的限制酶来说,其识别序列应为两个,而一些工具书、参考书中仅写为一个。本文通过一个酶切实验证明其识别序列为两个。同时希望通过本文,敦促一些工具书、参考书更正其错误。
Abstract:The recognizing sequence of restriction enzyme includes palindrome and nonpalindromic,and DNA is double helix complementary strands.So the recognizing sequences of palindrome enzyme in two strands of DNA were identical,and can be considered of one sequence.But for nonpalindromic restriction enzyme,the recognizing sequences of two strands of DNA were not identical.Therefore the true recognizing sequences are not only one.In this experiment,an enzyme cleavage reaction was carried out which confirmed that the true recognizing sites/sequences of nonpalindromic enzyme are two instead of one. 相似文献
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郑文尧 《生物化学与生物物理进展》1986,(5)
限制性内切酶Sau3AI是分子生物学与遗传工程研究的重要工具酶之一。它能确定DNA复制的起点或终点的位置,确定RNA在DNA上的转录位置,分析DNA中脱氧核苷酸序列的排列以及基因的分离等。 J.S.Sassenbach等人首先从StaPhylococcus aureus 3A(1)中提取限制性内切酶Sau3AJ,其切割序列为:5′G—A—T—C—3′3′—C—T—G—5″它除了对腺嘌呤的甲基化作用不敏感之外,是MboI的异源同功酶。我们参考J.S.Sussenbach等人的方法,并做了适当的改进,因而获得了较高纯度的Sau3AI核酶内切酶。一、材料与试剂 1、菌种:Staphylococcus aureus(本所保藏, 相似文献
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《中国生物工程杂志》2017,(8)
限制性核酸内切酶是DNA重组的重要分子生物学工具。由于其本身对DNA有切割作用导致其重组表达在技术上十分困难,产率低、提纯程序复杂。而商业化生产所采用的利用专一型甲基化酶保护宿主DNA的限制酶表达技术流程繁琐、实用性有限。为表达NotⅠ限制酶,采用来源于Spiroplasma sp.MQ1的DNA甲基化酶M.SssⅠ特异性甲基化CpG序列,甲基化后的DNA会免受识别位点中包含CpG序列的限制酶NotⅠ的切割。将甲基化酶M.SssⅠ导入大肠杆菌表达宿主ER2566后,M.SssⅠ基因在宿主中持续表达并甲基化宿主DNA成CpG甲基化样式;利用此表达体系制备限制性内切酶NotⅠ获得成功。并借助引入纯化标签经过简便的Ni亲和层析和阴离子交换层析2步层析洗脱纯化,制备了高活力高纯度的重组限制酶NotⅠ。此表达体系可应用于一系列识别位点中包含CpG序列的限制酶的表达。 相似文献
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