姜老师信箱

蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您蛋白质研讨班的学员,最近在纯化方面遇到了一点问题,想向您请教。我在做第一步纯化时,目的蛋白的活性总是很好,无论是用阴阳离子柱还是凝胶柱,都能获得很好的活性洗脱组分。但是到了第二步纯化,不管是离     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,在纯化一个糖蛋白,使用的是单抗与CNBr结合后的亲和层析,洗脱是0.1M甘氨酸,盐酸调节pH至2.5,样品用含有巯基乙醇的5×上样缓冲液煮沸十分钟,但结果显示分子量增加了很多,由36KD左右到了60KD。想向您请教原因。非常感谢!姜老师答:     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员。我们准备用溴化氰活化介质偶联α-银环蛇毒素装柱,溴化氰活化的琼脂糖4B是某知名公司的,空柱还没定,说明书上推荐的是HR 16/10。请问这款柱子我们可以用吗?急切盼望您的回复,谢谢!     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是第七期蛋白质分离纯化技术专题研讨班学员,我用强阴离子交换柱在HPLC上分离蛋白质时遇到了重现性方面的问题,恳请您赐教!蛋白性质:pI=4.7,Mw=28642,细菌来源,镍柱纯化。     

发酵液中L-色氨酸分离纯化工艺研究

通过静态吸附实验,考察了温度、pH值对001×7阳离子交换树脂平衡吸附量的影响,并测定了吸附动力学曲线。通过动态实验,测定了动态吸附曲线和洗脱曲线。最后确定了001×7阳离子交换树脂分离纯化L-色氨酸的最佳工艺条件:用001×7阳离子交换树脂吸附L-色氨酸,以浓度为2 mol.L-1氨水进行洗脱,收集的流份经D315阴离子交换树脂脱色,浓缩结晶后得L-色氨酸成品,总提取率为73.0%。     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是蛋白质研讨班的学员,我的课题是纤维素酶,上您的课收获很大,因为发现自己有好几步实验都做的不正确。在此我想咨询您几个问题:1.我只需要将纤维素酶脱盐、脱水浓缩,选用硫酸铵沉淀,之后透析的方法是否正确?有没有更好的方法?     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,在上课时听您讲过用Protein A纯化单克隆抗体的效果并不完美,请问这是不是由于纯化后抗体容易形成二聚体或多聚体,而导致活性下降?我还想请教一下:1.如果只     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我第十九期蛋白质分离纯化研讨班的学员。上课时您讲到渗透压冲击法破碎大肠杆菌比超声破碎可以降低1个数量级的杂蛋白,我有以下几个问题请教:1.使用这种方法如何区分是包涵体还是可溶性表达,是否跟超声破碎一样:破碎菌体后离心,分别取上清和沉淀跑SDS-PAGE?2.这种方法对包涵体表达是否适用?     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,您的授课让我获益良多。学习期间我曾向您请教过用NHS柱偶联抗原来纯化多克隆抗体的问题。关于偶联抗原蛋白量的计算,NHS柱商品说明书上显示配体密度为16-23μmol/ml干介质(ligand density:16-23μmol/ml drained medium),我使用的抗原分子量约为     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第十七期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,将要进行MBP融合蛋白纯化,向您请教几个问题:(1)哪家公司的直链淀粉树脂好?(2)纯化过程中有什么需要特别注意的问题?(3)Tris-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液哪个好?pH值影响大吗?为什么不同标签用不同裂解缓冲液?非常感谢!姜老师答:学员你好。     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我对蛋白纯化和大规模生产使用的纯化技术很有兴趣,有几个问题想向您请教:1.蛋白质复合物在生命体中是可溶状态吗?如果提取出体外,分子量较大的蛋白复合物(大于5000kDa)能以溶解状态存在吗?如果是胶体形式,会沉淀下来还是类似于悬浮液?(假定在pH7的水溶液中)     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第14期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,现在正在做有关茶叶、苹果等多酚氧化酶(PPO)分离纯化的实验,目的是为了得到PPO的纯品。目前我遇到一些困难,希望得到您的指点。我分离纯化PPO是通过匀浆、硫酸铵沉淀、DE-52阴离子交换柱、冻干进行的,我的问题如下:1.硫酸铵沉淀后的酶液,透析多久较合适?2.将酶液上样后,是     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第13期"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想请教您几个问题。我想用细胞培养的上清进行SDS电泳,但是总做不好,怀疑是上清中白蛋白含量较高。请问:细胞培养上清中会有白蛋白吗?如果有会影响SDS电泳吗?如果会影响,怎样把我的目的蛋白纯化出来,或者把白蛋白除去(我的目的蛋白大小是17kDa和34kDa)?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,向您请教样品洗脱的问题。样品之前在0-1.5mol/L氯化钠条件下无法洗脱,按照您讲的将洗脱液浓度提高到3mol/L(浓度依次是0.15、0.5、1、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0),除了0.15是10ml,其它的浓度洗脱了5ml,流速是0.75ml/min,出现梯度先升然后降的情况,在40-50min之间,只是洗下来一个小峰,样品峰未在梯度洗脱时出现。130min以后用1mol/L的NaCl加0.     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我在蛋白质分离纯化方面有两个问题想向您请教:1、工厂规模化生产蛋白(分子量约为15kDa),除了采用各种层析方式外,一般还可以用什么方法来对蛋白质进行浓缩?与实验室规模的蛋白纯化相比是否有不同之处?     

基于氢氘交换核磁共振技术研究蛋白质与阳离子交换介质的相互作用

原位实时捕捉多孔介质内的蛋白结构变化信息是蛋白质层析失活机理研究中的难点。为此,本文发展了蛋白质氢氘交换与核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)相结合的新型蛋白质液固界面表征路线。研究了溶菌酶在溶液态以及在阳离子交换介质内部吸附态时的去折叠行为,并揭示了蛋白与阳离子交换介质(SP Sepharose FF)相互作用机理。溶液态溶菌酶的一维核磁共振氢谱动力学显示蛋白质去折叠可导致残基暴露进而加快氢氘交换速率。吸附态溶菌酶的二维氢-氢全相关谱图(Total correlation spectroscopy,TOCSY)以及残基峰强度显示,溶菌酶在吸附态时的去折叠呈区域性,无规则卷曲(Coil,bend,and turn)片段的酰胺氢信号更容易失去,而二级结构域(α-helix,β-sheet)对酰胺氢信号保护更好。最终,利用蛋白表面静电势模拟计算结合氢氘标记的蛋白核核磁数据可确定出溶菌酶与阳离子交换介质的作用位点。这对于深刻理解层析过程中蛋白与层析介质微观作用机理以及层析过程中吸附剂的选择、设计具有重要意义,也为获取蛋白质与生物材料之间相互作用研究提供新的有效工具。     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想向您咨询一些蛋白质纯化问题。1.细胞破碎。我按照您的讲义内容进行低渗冲击(先等渗氯化钠、高渗葡萄糖,最后低渗溶液冰浴离心),破碎后蛋白浓度还可以,但有可能是我的细胞样品低温冻存的缘故,加入等渗氯化钠后就出现细胞破碎,上清就有蛋白了。这样损失很     

依赖雄激素的大鼠储精囊分泌蛋白的离子交换层析纯化

本文报道利用阳离子交换层析,纯化了雄激素依赖的大鼠储精囊分泌蛋白(SVPⅡ、SVPⅣ、SVPⅤ_a、SVPⅤ_b及SVPⅥ)。主要纯化步骤包括下列二步:1.Sep-hadex G-100凝胶过滤;2.上样后,联合使用盐梯度和pH梯度,洗脱快速蛋白液相层析(FPLC)系统的阳离子交换柱Mono S。洗脱峰的纯度以变性条件下的聚丙烯酰胶凝胶电泳(SDS-PAGE)和等电聚焦(IEF)鉴定;借此,还测定了已纯化的大鼠储精囊分泌蛋白的分子量和等电点。     

“观察根对矿质元素离子的交换吸附现象”实验的说明

在“观察根对矿质元素离子的交换吸附现象”的实验中,被吸收到根上的亚甲基蓝阳离子分为三部分:第一部分是可被蒸馏水从根上洗脱的亚甲基蓝阳离子,也就是实验中所指的“根上的浮色”;第二部分是与根细胞上的H~+离子交换后而到达根细胞的亚甲基蓝阳离子。它们不能被蒸馏水洗下来,但可以被Ca~(2+)离子交换下来,这是该实验要求观察的主要现象;第三部分则是那些既不能被蒸馏水洗脱,又不能被Ca~(2+)离子交换下来的亚甲基蓝阳离子。根上的亚甲基蓝阳     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,向您请教关于乳酸菌发酵液中分离小分子生物活性物质的问题。活性物质目前未知,初步猜测可能为环二肽,手性未知。我们合成后未检测到生物活性,所以需要重新进行分离纯化。