姜老师信箱

<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,有问题想向您请教。我在做蛋白的原核表达,用的是pkk223-3载体,表达菌株用了大肠杆菌JM109和TB1,发现表达蛋白均在包涵体中,降低IPTG浓度为0.05mM,降低诱导     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,向您请教关于乳酸菌发酵液中分离小分子生物活性物质的问题。活性物质目前未知,初步猜测可能为环二肽,手性未知。我们合成后未检测到生物活性,所以需要重新进行分离纯化。     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,在上课时听您讲过用Protein A纯化单克隆抗体的效果并不完美,请问这是不是由于纯化后抗体容易形成二聚体或多聚体,而导致活性下降?我还想请教一下:1.如果只     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第9和16期"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想向您请教几个问题。在我的实验中,双水相处理之后,蛋白质在上相,其中可能混有PEG和盐,体积也较大(大于上柱体积)。请问在上柱之前用什么方法浓缩好呢?因为PEG存在时超滤浓缩很难进行,是用透析和超滤,还是进一步用(NH4)     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第十七期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,将要进行MBP融合蛋白纯化,向您请教几个问题:(1)哪家公司的直链淀粉树脂好?(2)纯化过程中有什么需要特别注意的问题?(3)Tris-HCl缓冲液和磷酸盐缓冲液哪个好?pH值影响大吗?为什么不同标签用不同裂解缓冲液?非常感谢!姜老师答:学员你好。     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是第七期蛋白质分离纯化技术专题研讨班学员,我用强阴离子交换柱在HPLC上分离蛋白质时遇到了重现性方面的问题,恳请您赐教!蛋白性质:pI=4.7,Mw=28642,细菌来源,镍柱纯化。     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您蛋白质研讨班的学员,最近在纯化方面遇到了一点问题,想向您请教。我在做第一步纯化时,目的蛋白的活性总是很好,无论是用阴阳离子柱还是凝胶柱,都能获得很好的活性洗脱组分。但是到了第二步纯化,不管是离     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,在纯化一个糖蛋白,使用的是单抗与CNBr结合后的亲和层析,洗脱是0.1M甘氨酸,盐酸调节pH至2.5,样品用含有巯基乙醇的5×上样缓冲液煮沸十分钟,但结果显示分子量增加了很多,由36KD左右到了60KD。想向您请教原因。非常感谢!姜老师答:     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,听过您的讲座,受益匪浅,现在想向您咨询一些问题。我有200ml蛋白质样品,想采用羟基磷灰石层析纯化,但是样品溶液中含有1mmol/L的EDTA,请问有什么方法能够有效的去除EDTA,并且蛋白损失少?另外羟基磷灰石层析介质上螯合了少量EDTA,采用什么方法能够去     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,您的授课让我获益良多。学习期间我曾向您请教过用NHS柱偶联抗原来纯化多克隆抗体的问题。关于偶联抗原蛋白量的计算,NHS柱商品说明书上显示配体密度为16-23μmol/ml干介质(ligand density:16-23μmol/ml drained medium),我使用的抗原分子量约为     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想向您咨询一些蛋白质纯化问题。1.细胞破碎。我按照您的讲义内容进行低渗冲击(先等渗氯化钠、高渗葡萄糖,最后低渗溶液冰浴离心),破碎后蛋白浓度还可以,但有可能是我的细胞样品低温冻存的缘故,加入等渗氯化钠后就出现细胞破碎,上清就有蛋白了。这样损失很     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是第15期蛋白质分离纯化技术研讨班的学员,目前用渗透压冲击法提取细菌胞内酶,在优化条件时碰到了一些问题,实验步骤和部分结果请见附件(略)。希望得到您的回复,谢谢!姜老师答:你好!很高兴看到你发来的实验报告,但你没有完全按照我课程上讲的做:     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第9期和第16期"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,有问题想请教您。(1)我的目标蛋白大小约66kDa,在pET24a,BL21中有可溶性表达(提取时已加了PMSF,DNasI和少量Triton-X-100,3ul/60ml buffer),但是总得不到全长蛋白。(2)过Ni柱纯化不是很好。用50mmol/L咪唑也可以得到一些蛋白,但过Superdex 200后峰不尖,SDS-PAGE只能得到     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您第13期"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,想请教您几个问题。我想用细胞培养的上清进行SDS电泳,但是总做不好,怀疑是上清中白蛋白含量较高。请问:细胞培养上清中会有白蛋白吗?如果有会影响SDS电泳吗?如果会影响,怎样把我的目的蛋白纯化出来,或者把白蛋白除去(我的目的蛋白大小是17kDa和34kDa)?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,做抗菌肽等小分子多肽研究,向您请教包涵体的变性和增溶问题。我将线性抗菌肽串联在大肠杆菌中表达,用甲酸把串联的多肽裂解开,结果串联多肽以包涵体形式表达,甲酸也未能切开串联多肽。我又改用胃蛋白酶消化,但消化效果不好。现在准备用0.5MNaCl、10%乙醇、3%～5%PEG4000配合煮沸来使包涵体变性增溶,     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是蛋白质研讨班的学员,我的课题是纤维素酶,上您的课收获很大,因为发现自己有好几步实验都做的不正确。在此我想咨询您几个问题:1.我只需要将纤维素酶脱盐、脱水浓缩,选用硫酸铵沉淀,之后透析的方法是否正确?有没有更好的方法?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是"第十二期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,向您请教渗透冲击法破菌的问题。我把E.coli培养到OD 0.5左右,加40%蔗糖冰上10min,然后离心直接加与原箘液1,2,3,4倍体积的蒸馏水,放置观察,一直没有观察到细菌破坏。我们的蛋白是在胞浆里面的,也看了一些文献,似乎渗透冲击更适用于表达在细胞膜和细胞壁之间的周     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是蛋白质研讨班的学员,实验中有个问题向您请教。用硫酸铵沉淀镍柱亲和纯化的蛋白溶液后,用20mM PBS(pH6.8)复溶,接着用G25 5ml预装柱在AKTA纯化仪上脱盐,缓冲液为20mM PBS(pH6.8),出现了两个几乎等高的UV峰。第一个峰先于电导峰,第二个峰与电导峰重叠,SDS-PAGE显示两个峰均为目的蛋白(57kDa),而且4℃放置过夜之后,两个峰对应的溶液变浑浊。请您指点!     

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蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,想向您请教一下我在实验中遇到的问题。我的色谱图中可以明显看到几个相对独立的峰,但是在SDS-PAGE图中,150 kDa附近自始至终都出现条带;并且Fr.61-130和Fr.131-172两个峰的蛋白组成并没有太大差别,为什么还会分成两个不同的紫外吸收峰呢?     

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<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我有个实验问题向您请教。我的目的蛋白质应该是碱性,但使用一般的阳离子交换介质都是流穿,只有使用很强的阳离子交换介质,流穿不再有活性,但柱上活性回收很低。ELISA检测发现需要用NaOH洗脱主要部分,洗脱后测不到生物学活性。请问这是什么情况?该如何解决?谢谢您!