新建疫苗车间洁净度确认及环境监测微生物数据库的建立

目的对新建疫苗生产车间环境微生物检测方法及车间洁净度进行确认,建立环境监测微生物数据库。方法使用连续3批次的胰酪大豆胨琼脂(Tryptose soya agar,TSA)培养皿和TSA(L-80)接触碟对环境微生物检测方法进行确认;对新建车间连续进行3次静态和3次动态检测,包括悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物检测;对微生物检测所获得的菌株进行鉴定。结果确认了环境微生物检测方法的有效性,新建车间洁净度达到了设计要求,建立了环境监测微生物数据库,主要菌型为里拉/藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌、人葡萄球菌、科氏葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、表皮葡萄球菌。结论新建车间洁净度符合标准,环境监测微生物数据库的建立有助于污染源的调查分析,对无菌药品生产过程污染的有效控制提供了必要的技术保障和检测手段。     

PCR法快速鉴定眼源性蜡样芽胞杆菌

目的建立一种快速、灵敏、特异的眼源性蜡样芽胞杆菌PCR检测方法,为蜡样芽胞杆菌性眼内炎患者的快速诊断提供依据。方法选择编码蜡样芽胞杆菌细胞毒素的cytK为靶基因设计引物,建立检测眼源性蜡样芽胞杆菌PCR;PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定,基因序列与GenBank比对验证扩增产物;将计数过的5株蜡样芽胞杆菌菌悬液,梯度稀释后分别提取DNA进行PCR扩增,确定检测方法的灵敏度;分别用眼部常见感染菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、化脓性链球菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌和白假丝酵母菌以及枯草芽胞杆菌DNA进行特异性试验;进一步将该方法应用到人工污染致病蜡样芽胞杆菌的房水标本中,并分析其灵敏度。结果5株分离自眼内炎患者标本中的蜡样芽胞杆菌均扩增出360bp左右的DNA片段,测序结果与GenBank比对一致;该法检测在5h内完成,方法灵敏度达7．5～15．0CFU／mL;其他菌株检测未出现非特异性扩增;对模拟感染房水标本的PCR鉴定结果与分离培养对比,二者符合率为100％,模拟标本的检测灵敏度与纯菌结果一致。结论cytK基因为靶基因的PCR用于眼源性蜡样芽胞杆菌的快速检测,具有简便、快速、敏感、特异等特点,为眼内炎患者的快速诊断提供依据,在实际检验工作中有良好的应用前景。     

VITEK 2 Compact微生物检测系统在生物制剂无菌环境监测中的应用

目的通过收集生物制剂生产中洁净间环境微生物、微生物限度检测样品,应用全自动微生物检测系统(VITEK 2 Compact)进行监测分析,评价其适用性。方法利用革兰染色法和VITEK 2 Compact系统对4种标准菌株和291个纯菌鉴定样本进行方法学验证;对人员及设备表面微生物、沉降菌及微生物限度样本共313个进行菌型鉴定,确认此系统在生物制剂生产中的应用价值。结果共在收集的313个样本中,共检出微生物268株,其中人员及设备表面微生物18株、沉降菌188株、微生物限度62株。可信度均在93%以上。其中革兰阳性菌:藤黄/里拉微球菌46次,库克菌属35次,葡萄球菌属70次;阴性菌:少动鞘氨醇单胞菌38次,鲁氏不动杆菌7次。结论 VITEK 2 Compact微生物检测系统具有高度特异性、敏感性和重复性,并具有操作简便、检测速度快等优点,可广泛应用于医院及疾控中心,尤其对无菌生产环境中微生物的质控和微生物数据库的建立具有重要意义。     

普洱茶中微生物的筛选及其安全性初步评价

目的在对普洱茶中微生物筛选和鉴定基础上对蜡样芽胞杆菌毒素基因的分布、普洱茶下调毒素基因的表达和改善肠上皮细胞的损伤进行研究。方法分别采用无菌水和沸水泡制普洱茶,获得分离株,通过16SrDNA测序以及生理生化试验确定其归属;对所筛选的菌株进行耐模拟胃肠液能力评价和毒力基因的检测;采用细胞实验和荧光定量PCR技术,研究普洱茶对蜡样芽胞杆菌毒素的抑制作用。结果无菌水浸泡普洱茶获得的45株菌中44株为芽胞杆菌属,沸水浸泡获得的7株菌均为蜡样芽胞杆菌(FBCE01、FBCE06、FBCE10、FBCE14、FBCE20、FBCE26和FBCE29),多重PCR技术结果表明其分别含有毒力基因cytK、nheA和hblD的2种或3种。耐模拟胃肠液实验表明,7株菌均具有很强的耐模拟胃肠液消化能力;细胞实验结果发现,普洱茶汤能显著降低蜡样芽胞杆菌对Caco-2细胞的粘附(P0.05);MTT实验结果显示,普洱茶能有效降低蜡样芽胞杆菌对细胞的损伤;荧光定量PCR技术结果进一步说明,普洱茶使蜡样芽胞杆菌肠毒素的mRNA表达水平下调。结论普洱茶具有抑制蜡样芽胞杆菌毒素的作用。     

牛樟芝发酵液提取物抗菌活性研究

牛樟芝作为一种珍稀食用和药用菌,具有极大的开发潜力。该研究以麦芽浸粉肉汤液体培养基(BD,美国BD公司)对牛樟芝菌丝体进行摇床培养60 d后,收获发酵液并用乙酸乙酯对其进行萃取,浓缩至干获得提取物;同时,采用抑菌圈法评价培养物对13种致病细菌抗菌活性(蜡样芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、无乳链球菌、短小芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌、铜尿假单胞菌、乙型副伤寒沙门氏菌、大肠埃希菌),并检测相应致病细菌的最低抑制浓度(MIC)。结果表明:牛樟芝麦芽浸粉肉汤发酵液提取物对供试的13种致病菌均有抑菌活性;在供试的13种致病菌中,提取物对缓慢芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、副溶血性弧菌、藤黄微球菌5种致病菌的最低抑制浓度值均小于80μg·m L~(-1),其中对藤黄微球菌的最低抑制浓度最低为66.5μg·m~(-1);随着培养时间的增加,提取物的抗菌活性也增加。这说明牛樟芝菌丝体在液体培养条件下,能够产生广谱高效抑菌活性的次生代谢产物。该研究结果为牛樟芝进一步的有效利用开发奠定了理论基础。     

锦灯笼宿萼提取物体外抗菌作用研究

采用纸片扩散法对锦灯笼宿萼提取物进行体外抗菌试验研究,以了解其抗菌谱。结果表明该提取物对金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌均有抑制作用,而对绿脓杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌以及白色念珠菌均无抑制作用,表明锦灯笼宿萼提取物中存在有效抗菌成分,其中以甲链、乙链、金葡菌高度敏感,锦灯笼宿萼精制提取物最低抑制浓度为25~50 g/L。     

野生东亚钳蝎消化道可培养细菌的分离鉴定、耐药性及产消化酶活性

目的分离东亚钳蝎消化道中的可培养细菌,并研究其产消化酶活性和耐药性,探讨消化道细菌对东亚钳蝎消化食物的影响。方法野生东亚钳蝎采用传统细菌分离培养方法分离其消化道内可培养细菌,利用16S rRNA序列进行细菌的分子鉴定;利用平板透明圈法测定可培养细菌产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等消化酶的活性;采用药敏纸片扩散法进行消化道可培养细菌的药敏试验。结果在东亚钳蝎消化道中共分离到4个属10种细菌,其中芽胞杆菌属7种,分别为蛋白水解芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、婴儿芽胞杆菌和长形赖氨酸芽胞杆菌;葡萄球菌属、纤维微菌属和短波单胞菌属各1株,分别为松鼠葡萄球菌、纤维化纤维微细菌和泡囊短波单胞菌。对10种细菌的产消化酶活性分析表明,8种细菌有产消化酶活性,占细菌总数的80%;5种细菌有产蛋白酶活性,分别为蛋白水解芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、松鼠葡萄球菌和纤维化纤维微细菌;7种细菌有产淀粉酶活性,分别为蛋白水解芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、松鼠葡萄球菌和婴儿芽胞杆菌;未筛选到产纤维素酶和脂肪酶活性的细菌;蛋白水解芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和松鼠葡萄球菌可同时产2种消化酶。在药敏试验中,8种细菌对多粘菌素B耐药,5种细菌对四环素耐药,3种细菌对万古霉素耐药。结论东亚钳蝎消化道中可培养细菌的组成相对单一,多数细菌有分泌淀粉酶和蛋白酶的功能,说明东亚钳蝎消化道中的细菌可能有协助其进行食物消化的功能。消化道细菌对抗生素多表现为敏感,推测其生存环境中抗生素的污染较少,同时在对东亚钳蝎人工饲养的场所进行消毒时,要谨慎选择抗生素,防止抗生素使用不当致使东亚钳蝎肠道菌群紊乱引起疾病。     

施用微生物制剂对育蚌水体微生物区系的影响

研究了育蚌水体分别施用微生物制剂利水素与鱼虾菌乐后水样中微生物区系的变化。试验结果表明:施用利水素的水样革兰氏阴性杆菌和嗜水气单胞菌含量分别下降26.67%、20%,芽胞杆菌和表皮葡萄球菌含量分别上升13.33%、26.67%;施用鱼虾菌乐的水样革兰阴性杆菌和嗜水气单胞菌含量分别下降20%、13.33%,芽胞杆菌和表皮葡萄球菌含量分别上升6.67%、13.33%;未施用微生物制剂的水样革兰阴性杆菌和嗜水气单胞菌含量均上升13.33%,芽胞杆菌消失,新增肠杆菌和链球菌。施用微生物制剂利水素和鱼虾菌乐,可有效优化养殖水体微生物种群结构,改良养殖水质环境。     

多脂长喙壳菌次生代谢产物的抑菌活性研究

植物病原真菌是生态系统的重要组成部分,能够代谢产生多种生物活性物质。用纸片法检测多脂长喙壳菌(Ceratocystis adiposa)发酵提取物对13种致病细菌的抑菌活性,并对潜在抗菌活性化合物的热、酸碱和光稳定性进行检测,同时应用OSMAC策略寻找多脂长喙壳菌产抗菌化合物的最佳培养条件。结果表明:多脂长喙壳菌提取物对革兰阳性菌——蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、缓慢芽胞杆菌(Bacillus lentus)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)具有抗菌活性,MIC分别为6.25、3.125和1.562 5 mg/m L,抗菌化合物具有较好的耐热、耐酸碱和耐辐射性,培养基种类、培养时间和接种量会影响多脂长喙壳菌抗菌化合物的产生,为多脂长喙壳菌抗菌化合物的开发利用提供参考。     

乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2全基因组序列测定及基因遗传稳定性

目的对乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株进行全基因组序列测定和分析,并观察该生产株在疫苗制备过程中的基因遗传稳定性。方法根据DNA序列数据库(Gen Bank)公布的SA14-14-2株的序列,设计合成7对引物,提取疫苗生产株SA14-14-2及其工作种子批生产的3批原液、3批成品疫苗的病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SA14-14-2株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至大肠埃希菌DH5α中,挑取阳性菌落克隆、鉴定后测定全序列并对序列进行比较分析,观察毒株在传代的过程中病毒滴度的稳定性。结果乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株基因组全长10 976 bp,编码3 433个氨基酸。3批原液和3批成品疫苗的基因组全长为10 977 bp,比较分析发现,在3'端非编码区10 701处多一个G核苷酸的插入。与DNA序列数据库(Genbank)登录号为D90195的全长序列同源性分别是99.9%、99.9%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%、99.8%,其中E蛋白的同源性均为100%。SA14-14-2生产株的病毒滴度为7.22 lg PFU/mL,原液和成品疫苗的滴度分别为7.32、7.23、7.32、6.86、6.92、6.70 lg PFU/mL。结论乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2基因稳定,具有良好的一致性,为乙型脑炎减毒活疫苗的质量的稳定性提供了可靠依据。