核定位信号筛选系统的构建

建立了一酵母克隆系统用于克隆含核定位信号 (NLS)的蛋白质的基因 .用表达转录因子GAL4 DNA结合域 - p53(GAL4- DBD- p53)融合蛋白的质粒转化酵母 HF7c,使 GAL4- DBD- p53可结合于报告基因的启动子但因无转录激活域而不能激活转录 .构建一酵母穿梭载体 ,可表达无NLS的 GAL4转录激活域 -大 T抗原 (GAL4- AD- LT)融合蛋白 .融合蛋白基因的下游插入一多克隆位点 .将 c DNA文库插入多克隆位点后 ,如果 c DNA片段可编码 NLS,则 GAL4- AD- LT分子可进入细胞核 ,并通过 LT与 p53的相互作用而使 GAL4- AD结合于启动子和激活报告基因的转录 .构建了这一克隆系统的各质粒 ,并用绿色荧光蛋白 (GFP)验证了其对核内蛋白和胞浆蛋白的甄别能力 .这一系统将有助于从 c DNA文库中筛选编码带有 NLS的蛋白质的基因     

拟南芥WRKY61转录因子的转录活性与互作蛋白分析

该研究采用双荧光素酶报告系统、酵母双杂交和双分子荧光互补实验,对拟南芥AtWRKY61的转录活性及与AtWRKY61转录因子的互作蛋白进行了分析,并用qRT-PCR方法分析AtWRKY61对多种非生物逆境的响应特征,为进一步揭示AtWRKY61的功能与分子调控机制奠定基础。绿色荧光蛋白介导的亚细胞定位分析显示,AtWRKY61定位于细胞核内;基于原生质体的双荧光素酶报告系统和酵母实验发现,AtWRKY61具有转录抑制活性。qRT-PCR分析表明,AtWRKY61对多种非生物逆境的处理具有明显的响应,可能是在多条信号通路中发挥作用。酵母双杂交与双分子荧光互补分析表明,AtWRKY61与自身以及同组的AtWRKY9和AtWRKY72存在互作关系,暗示可能通过形成WRKY复合物来行使特定的转录抑制功能。     

大鼠老化过程大脑皮层细胞核、染色质转录研究

 本实验对不同鼠龄(4—,16—17—,33—34—和99—103周)大鼠老化动物模型进行脑细胞核、染色质体外转录研究,结果表明:(1)大脑皮层细胞核、染色质转录活性在老化过程中呈下降趋势,其中RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ活性与染色质模板效率变化一致,说明染色质模板活性降低是导致细胞核转录功能减退的原因之一。(2)幼年鼠染色质RNA和NHCP含量高于老年鼠,提示染色质结合蛋白及RNA可能参与不同生理时期脑神经元染色质结构和功能的调节。(3)老年鼠脑染色质DNA抗DN-aseⅠ酶解能力增强,提示衰老导致转录活性染色质区域减少。     

CREB4基因的表达谱分析和功能初步研究

cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponseelement-bindingproteins,CREB)是一个哺乳动物转录因子家族,通过cAMP反应元件(cAMPresponseelement,CRE)介导cAMP和钙离子依赖性基因表达。CREB4是CREB转录家族的新成员。人肿瘤MTCpanel结果显示,CREB4在人肺癌LX-1、结肠腺癌CX-1、前列腺癌PC-3、结肠癌G1-112和胰腺癌G1-103中有表达。构建表达CREB4-LexA和CREB215~395aa-LexA的pLexA融合质粒分别转化含p8opLacZ报告质粒的酵母EGY48菌株,诱导表达后发现CREB4蛋白为转录激活因子,N端决定其转录激活活性。亚细胞定位结果显示,全长CREB4蛋白定位于细胞质,而缺失C端假定转膜结构域的CREB41~275aa蛋白突变体则转移至细胞核内。表达谱结果显示CREB4蛋白可能在人多种肿瘤组织的基因表达调控中起作用,其C端假定的转膜结构域与其转录激活功能密切相关。     

核小体定位模式及其与DNA甲基化位点分布的关系

核小体定位是指DNA双螺旋相对于组蛋白八联体的位置.核小体定位通过限制蛋白结合位点参与基因转录调控.本文利用实验检测的人类CD4+ T细胞核小体定位数据,研究了核小体定位在转录因子结合位点(TFBS)和转录起始位点(TSS)附近的分布模式,并分析了在TFBS和TSS周围,核小体定位与DNA甲基化之间的关系.结果表明,在休眠和激活的人类CD4+ T细胞中,部分TFBS和TSS周围的核小体定位在动态改变,即在定位和缺失两种状态之间切换.在TFBS周围,核小体定位和DNA甲基化存在一种互补模式,核小体定位与DNA低甲基化相联系;而在TSS周围,两者呈现同步模式,DNA高甲基化伴随高核小体水平.而且,在TFBS和TSS周围,DNA甲基化位点的分布呈周期模式.CD4+ T细胞被激活时,较少的转录因子启动了较多的基因.     

青杄转录共激活因子PwMBF1c的功能研究与验证

克隆通过青杄干旱转录组筛选到的差异候选基因PwMBF1c,对其生物学功能进行分析和验证,以期能够解析青杄的耐旱机理,并为培育优良抗逆林木品种提供基因资源。利用RT-qPCR技术分析PwMBF1c对干旱、高温、低温及激素处理的响应。瞬时转化烟草叶片和洋葱表皮细胞检测PwMBF1c的亚细胞定位。利用酵母单杂验证PwMBF1c的转录活性。在拟南芥和马铃薯体系中验证了PwMBF1c抗旱应答的功能。PwMBF1c主要在成熟叶中表达,其转录水平受干旱、高温、水杨酸（SA）诱导上调;PwMBF1c的C端具有转录激活活性,而N端和全长不具有转录活性;PwMBF1c定位于细胞膜、细胞质和细胞核;过表达PwMBF1c显著提高了拟南芥和马铃薯的耐旱性。干旱胁迫下,与对照组Col-0和VC相比,过表达拟南芥株系PwMBF1c-L1和PwMBF1c-L2存活率更高,叶绿素含量较高,MDA含量较低;在PEG处理后,与野生型马铃薯Y5相比,过表达PwMBF1c显著提高了苗高。PwMBF1c的表达水平受干旱等多种逆境和激素的诱导,PwMBF1c主要定位于细胞膜、细胞质和细胞核,且该蛋白的C端具有转录激活活性。PwMB...     

γ-线辐射对大鼠肝脾染色质及转录活性染色质模板活性的影响

 本文从染色质及转录活性染色质的模板效率探讨辐射对核转录活性影响的机制。实验结果表明:(1)肝脾染色质模板功能的变化分别平行与肝脾细胞核转录活性的变化提示,辐射至少部份是通过改变染色质的模板功能而影响细胞核的转录活性;(2)体外照射下,活性染色质模板活性较非活性染色质改变明显,提示射线可能主要是通过影响活性染色质区域的模板功能而改变核合成RNA的能力。     

新疆野苹果MsCBF1基因的克隆及表达分析

新疆野苹果是现代栽培苹果的祖先,对非生物胁迫具有很强的适应性,是非常珍贵的天然基因资源库。本研究以新疆野苹果RNA为模板,RT-PCR扩增出CBF1基因c DNA序列,命名为Ms CBF1。Ms CBF1基因完整开放阅读框ORF长660 bp,编码219位氨基酸,具有CBFs类转录因子典型的AP2保守结构域。亚细胞定位显示Ms CBF1蛋白作用于细胞核;转录激活活性分析显示Ms CBF1蛋白具有转录激活活性,其激活活性区域位于C端第166~219位氨基酸之间。基因表达分析显示,Ms CBF1基因响应盐(200 mmol·L~(-1 )Na Cl)和冷(4°C)胁迫诱导,不响应干旱(300 mmol·L~(-1)甘露醇)胁迫诱导。     

青杄转录因子PwNAC30及其启动子序列的克隆与表达分析

该研究以青杄(Picea wilsonii)为实验材料,通过PCR从青杄的cDNA文库中克隆得到一个NAC转录因子,命名为PwNAC30。生物信息学分析显示,PwNAC30开放阅读框1 179bp,共编码392个氨基酸,在其N端存在保守的NAM(no apical meristem)结构域,可分为A～E等5个亚结构域。多序列对比和系统进化树分析显示,PwNAC30蛋白与同为云杉属的北美云杉(Picea sitchensis)聚为一类。启动子克隆分析显示,PwNAC30基因启动子上存在脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、TC-rich repeats等激素和逆境响应元件,在GA、ABA、MeJA、低温、干旱、盐的处理下,其启动子活性均明显增强。荧光定量PCR分析表明,PwNAC30在球果中的表达量最高,而在花粉和种子中的表达量最低。PwNAC30对于盐、干旱、低温、ABA、MeJA、GA处理均有响应,尤其对盐、干旱、MeJA的响应最为显著。亚细胞定位结果显示,PwNAC30蛋白定位于细胞核与细胞质,主要定位于细胞核中。酵母单杂及双杂结果表明,PwNAC30蛋白的全长和N端没有转录激活活性,而C端有转录激活活性,且PwNAC30自身能形成同源二聚体。研究表明,青杄PwNAC30基因可以作为一个转录因子发挥作用,其转录激活活性在C端,且自身能够形成同源二聚体结构;PwNAC30基因广泛参与了ABA、GA、MeJA等激素的信号通路,并对盐、干旱、低温处理有响应。     

茶树CsCBF1基因克隆和转录活性分析

采用RACE技术克隆了一个受冷诱导的茶树CBF基因全长cDNA,命名为CsCBF1(GenBank登录号为EU563238)。CsCBF1cDNA全长序列为1 211bp,开放阅读框编码259个氨基酸。氨基酸序列分析表明,CsCBF1具有CBF家族典型的保守结构域,与其他植物的CBF具有较高的相似性;与拟南芥、辣椒和橡胶树编码的CBF相似性分别为56%、63%和56%。亚细胞定位结果表明,CsCBF1位于细胞核内。分别将10个CsCBF1缺失突变体与GAL4DNA结合域融合的结果显示,CsCBF1的羧基末端酸性结构域(第137位氨基酸至259位氨基酸)在酵母中具有转录激活活性。实时定量RT-PCR分析表明,CsCBF1基因受低温的快速诱导表达。