高山被孢霉Δ5脱饱和酶基因的分离与验证

花生四烯酸(arachidonicacid)是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6(Mortierellaalpina)中通过RT-PCR分离了可能的编码Δ5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有Δ5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b5结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱(GC-MS)分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出Δ5脱饱和酶基因。     

被孢霉△~9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析

被孢霉被广泛采用用于发酵生产γ-亚麻酸、花生四烯酸和EPA等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆△~9脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,PCR扩增了被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被抱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区由537个核苷酸组成,共编码179个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物面△9脂肪酸脱饱和酶基因有很高的同源性。这是被饱霉△~9脂肪酸脱饱和酶基因研究的次次报道。     

实时PCR分析△5脱饱和酶在花生四烯酸合成中的作用

花生四烯酸是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。 Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径中催化二高-γ-亚麻酸脱饱和为花生四烯酸的酶。本研究通过实时定量PCR技术,检测了Δ5脱饱和酶在不同花生四烯酸产量的高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株M10,M6和M23中的mRNA表达水平,以及在高产花生四烯酸菌株M6培养过程中的mRNA表达水平的动态变化,发现Δ5脱饱和酶基因的mRNA表达水平与花生四烯酸的产生之间存在明显的线性关系,表明Δ5脱饱和酶是高山被孢霉中花生四烯酸合成途径中起到了非常重要的作用。     

被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析*

被孢霉被广泛采用用于发酵生产Y一亚麻酸、花生四烯酸和EPA等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆△9脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,PCR扩增了被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区由537个核苷酸组成,共编码179个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物△9脂肪酸脱饱和酶基因有很高的同源性。这是被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因研究的次次报道。     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸(GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。△^6-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3．5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析表明高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16．26％。     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸（GLA）作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3.5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱质谱（GC-MS）联用分析表明高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16.26%。     

深黄被孢霉△5-脱饱和酶基因在花生四烯酸合成中的作用

【目的】研究△5-脱饱和酶基因的mRNA表达量与花生四烯酸产量之间的关系。【方法】实验利用荧光定量PCR方法检测了△5-脱饱和酶在五株深黄被孢霉的同一培养时间及菌株YZ-124在不同发酵阶段的mRNA表达水平,同时利用气相色谱仪测定其花生四烯酸含量。【结果】结果表明:不同菌株的△5-脱饱和酶基因的mRNA表达水平不同,原始菌株As3.3410最低,诱变菌株YZ-124最高;深黄被孢霉YZ-124不同发酵阶段的△5-脱饱和酶基因mRNA表达量随菌龄的增加逐渐增加。【结论】结合ARA的得率显示,△5-脱饱和酶基因mRNA表达量与培养物油脂中ARA含量呈一定的正相关关系。     

深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（GLA,C18：3△^6,9,12）是由△^6-脂肪酸脱氢酶以亚油酸（LA,C18：2△^9,12)为底物,在C6位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△^6-脂肪酸脱氢酶的cDNA,全长为1374个核苷酸,编码457个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,△^6-脂肪酸脱氢酶在其序列的N端特有细胞色素b5(Cytb5)区。这是国际上对深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

被孢霉Δ^9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析

被孢霉被广泛采用用于发酵生产γ－亚麻酸、花生四烯酸和ＥＰＡ等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,ＰＣＲ扩增了被饱霉Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被孢囊Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因保守区由５３７个核苷酸组成,共编码１７９个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物Δ＾９脂肪酸脱饱和酶基因有很高     

三角褐指藻△5-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

△5-脂肪酸脱氢酶是合成花生四烯酸的关键酶.根据已报道的△5-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从三角褐指藻基因组DNA和总cDNA中扩增得到1520 bp和1410 bp的特异片段,序列分析结果显示,结构基因中含有一个大小为110 bp的内含子,这是国内外首次报道.将△5-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0中,在大肠杆菌中筛选到含有目的片段的重组质粒pYPTD5,用电击转化的方法将重组质粒pYPTD5转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在缺省培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YPTD5,在合适的培养条件下,添加外源底物双高γ-亚麻酸和诱导物半乳糖,培养并收集菌体.通过脂肪酸甲酯气相色谱分析,表明三角褐指藻△5-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效的表达,将双高γ-亚麻酸转化为花生四烯酸,其底物转化率达到了45.9%.     

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达

以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,将质粒pRH2304转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析,荧光显微观察结果表明GFP在YM25235获得表达,建立了红冬孢酵母YM25235遗传转化方法。在此基础上,以高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因取代pRH2304中的GFP基因,构建重组质粒pRH2304MAD6,将其转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析。PCR结果表明,高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已经整合到YM25235基因组中,进一步的脂肪酸气相色谱分析结果表明,该基因编码产物催化n-6途径中的亚油酸转化成γ-亚麻酸,占细胞总脂肪酸的4.35%,但没有检测到催化n-3途径中的α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸。     

高山被孢霉Δ6Ⅱ-脱饱和酶的克隆、表达和功能鉴定

产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对其中的Δ6-Ⅱ脱饱和酶进行克隆、表达和功能鉴定。首先以p YES2/NT C质粒为骨架构建了Δ6-Ⅱ脱饱和酶基因(FADS6-Ⅱ)的表达载体(p YES2/NT C-FADS6-Ⅱ),并转化至酿酒酵母中进行诱导表达,进一步通过在重组菌培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察Δ6-Ⅱ脱饱和酶对各底物的偏好作用。实验结果表明,在分别添加0.5 mmol/L亚油酸(LA)和0.5 mmol/Lα-亚麻酸(ALA)时,Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为42.94%,对ALA没有催化作用。而当底物添加方式改为同时添加LA和ALA时(分别为0.25 mmol/L),Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为37.12%,对ALA仍没有催化作用。该实验结果为高山被孢霉中Δ6-Ⅱ脱饱和酶的催化功能研究提供了理论依据。     

△6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好

添加α-亚麻酸作为底物,经半乳糖诱导,在含有少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成;同时添加亚油酸和α-亚麻酸时,检测到γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,而且十八碳四烯酸的含量是γ-亚麻酸含量的3.81倍,表明在酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶不仅能催化α-亚麻酸生成十八碳四烯酸,而且偏好n-3途径中的底物α-亚麻酸.同样,在改变少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有明显提高.     

高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

△^6－脂肪酸脱氢酶基因是形成γ－亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6－脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC－Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC－MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6％的γ－亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6－脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ,Ｃ１８：３△６,９,１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ,Ｃ１８：２△９,１２）为底物,在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ,全长为１３７４个核苷酸,编码４５７ 个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是, △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

海洋破囊壶菌△4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒母中的表达

以质粒pGEM-TFAD4为模板,扩增获得1.6 kb的△4-脂肪酸脱饱和酶基因(FAD4).将FAD4酶切后连接到Hond Ⅲ/XbaⅠ处理过的pYES2.0载体,构建重组表达质粒pYFAD4.转化酿酒酵母缺陷型菌INVScl,通过SC-U选择性培养基筛选阳性克隆子.添加外源脂肪酸C22:5底物,半乳糖诱导表达.气相色谱分析表明阳性克隆子总脂肪酸中出现了二十二碳六烯酸C22:6(占酵母总脂肪含量的41.13%),△4-脂肪酸脱饱和酶基因在酿酒酵母中得到了表达.     

深黄被孢霉M6-22△6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术,从含有深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中,扩增出1.38kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中,在SC-Ura合成培养基中,选择到酵母工程株YMID6.在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体.通过GC-MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析,结果表明,γ-亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的8.69%.     

深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ,Ｃ１８：３△_{６,９,１２}）是由△_６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ,Ｃ１８：２△_９,１２）为底物,在Ｃ_６位脱氢形成的。由于在人体中,γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物,而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物,利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△_６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ,全长为１３７４个核苷酸,编码４５７ 个氨基酸,但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是, △_６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ_５（Ｃｙｔｂ_５）区。这是国际上对深黄被孢霉△_６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。     

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）As 3.38△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆与酵母表达

通过气相色谱法(GC)快速分析8种真菌的脂肪酸成分,发现匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)具有较高的γ-亚麻酸含量,利用RT-PCR和RACE方法获得了全长为1475bp的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列,其中开放阅读框为1380bp,编码459个氨基酸。生物信息学分析所克隆的基因具有△6-脂肪酸脱氢酶的典型结构:N端具有细胞色素b5结构、具有3个保守的组氨酸区序列和跨膜结构;把该基因的开放阅读框序列连接到表达载体pYES2.0上,构建重组表达载体pYRnD6D,并将其转入缺陷型酿酒酵母INVScl中进行表达。GC分析表明,该序列在酵母中获得了表达,表达产物表现出△6-脂肪酸脱氢酶的酶学活性,能将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸。新生成的γ-亚麻酸占酵母细胞总脂肪酸的12.25%。     

Δ^6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好

添加α-亚麻酸作为底物,经半乳糖诱导,在含有少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成;同时添加亚油酸和α-亚麻酸时,检测到γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,而且十八碳四烯酸的含量是γ-亚麻酸含量的3．81倍,表明在酿酒酵母中少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶不仅能催化α-亚麻酸生成十八碳四烯酸,而且偏好n-3途径中的底物α-亚麻酸。同样,在改变少根根霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有明显提高。