应用电激法在大肠杆菌中导入外源性DNA

本文报道用国产基因导科脉冲仪(LN－101型),采用高压脉冲电场,将质粒DNA和噬菌体DNA成功地转化或转导人大肠杆菌。该电场单次电压脉冲范围1．Okv一2．5kv(初电场强度2,8kV／cm一16kV／cm)、电容范围5—20μF,用质粒pUC18和受体菌株DH5α,获得10　9－10　10转化子／μgDNA。电场强度、电容及脉冲时间等不同的因素影响转化效率。转化率与DNA的强度呈线性关系,与受体细胞密度成正比。 DNA和受体菌混合物在电激前,后的孵育时间,对转化效率影响不明显。用噬菌体M13mp 19 RF及受体菌株JMl09,同样可获得较高的转化效率。     

DH10B菌株高效电转化条件探究

以pUC19、pECBAC1、pCLD04541DNA以及3个不同大小的BACDNA为材料,研究了E.coli DH10B菌株在5个不同脉冲电场下的转化效率。研究发现,随着DNA片段大小的增加,最高转化效率和最适场强迅速减小。利用DH10B细胞转化pUC19 DNA的最适场强是21kV/cm,而190kb BAC DNA仅为13kV/cm;在最适场强下,40kb BAC DNA的转化效率约是190kb BAC DNA的50倍。通过大量数据绘制了不同因素影响下转化效率的变化曲线,优化了E.coli DH10B菌株电转化条件,为质粒的重组转化以及大片段基因组文库的构建奠定了基础。     

组织与原生质体培养

950616从电激原生质体再生转基因大豆植株[英]/Dhir,S.K.…/P1ant Physi01.一1992,99(1).一81～88E译自DBA,1992,11(14),92—08040] 质粒DNA携带CaMV35S启动子调控的新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因,该基阈与冠瘿碱生物合成的非选择标记相连。从上述质粒电激处理后的原生质体衍生愈伤,并再生出转基因大豆植株。从电激后培养的第15天开始,用卡那霉素(50pg/m1)选择。6周内,从1百万个电激原生质体中选出370～460个抗性集落,绝对转化频率为O.00037～O.00046。其中80％以上的集落具有NPT’Ⅱ活性,这些集落的90％产生冠瘿碱。连接的标记基…     

霍乱毒素B亚基基因上游序列对B亚基表达水平的影响

本研究通过缺失突变和移码突变研究了ctxB基因上游A基因部分序列对ctxB表达水平的影响,结果表明:(1)将ctx操纵子XbaI—EcoRI片段克隆至pUC19,构建的质粒pUC19CTB中A亚基的部分序列不能翻译,该质粒转化大肠杆菌后CTB的表达产量为30μg/ml;(2)在质粒pUC19CTB的XbaI位点引入移码突变,构建质粒pMC02C,这时A亚基的部分序列的阅读框架与lacZ一致,从而A基因能够翻译至自然的终止密码,B基因的表达水平却降低一倍;(3)质粒pUC19CTB缺失XbaI～ClaI(550bp)的非翻译序列,构建质粒pMC03(A亚基序列不翻译),该质粒转化大肠杆菌后ctxB基因的表达水平降低1倍;(4)在质粒pMC03中ctxB基因上游引入移码突变,构建的质粒pMC03C(ctxB上游基因能够表达)CTB的表达水平较pMCO3低得多,较pUC19CTB低20倍以上。对产生上述现象的原因进行了分析讨论。     

质粒研究与载体构建

920009构睡能在AmyeolatoPsis mediterranei中盆御的杂交质较〔英〕/Lal,R.…/ApPI.Environ.Mierobiol一2991,57(3)一665~671[译自DBA,1991,10(9),91一94832〕 从A.仍e“‘e,,“。e‘DSM43387中分离到质粒pA387(29.6kb)。经原生质体化、澳乙咤或热处理可低频消除该质粒。该质粒属游离型,不整合到染色体中。将一个5.Ikb的pA38了片段擂人大肠杆菌载体质粒pDM10中,构建成杂交质粒pRLI。该质粒可被电激转化至A.仍。J“e,,a。。云及A。o,亏e:‘a乙妞s中。对前者,用i2.skV/em、10。6也sec条件,转化频率为22。。/拼9 DNA;对后者,用7.s…     

基因工程

900573 通过电激作用对类肠膜明串珠菌的质粒转化及其在分子克隆中的用途[英]/David. S. …∥ Appl. Environ. Microbiol.-1989,55(6)-1483～1489[译自DBA,1989,8(15),89-08707] 报道了利用电激对类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)的转化。对决定转化率的几个因子作了最优化处     

一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA转化大肠杆菌的操作方法.采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞.以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth和植物双元表达栽体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1.质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后,直接涂布含有筛选抗生素的LB平板,于37℃培养12～16h.结果表明,用不同大小的质粒DNA转化不同的大肠杆菌菌株,都可以获得满足实验要求,转化效率可高达103～4阳性克隆/μg.该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用.     

基因工程

951 958用质粒DNA电激硫杆菌ThiobaciII U S ve rsutusl"英]/Wloda rczyk, M.…∥Acta Microbi01.P01.一1994,43(2).一223~227[译自DBA,1995,14(2),95—00702] 利用各种5～100kb的质粒可成功地向缺失其天然质粒PTAViSj硫杆菌Thiobaci Zl“s versu-tus UW225导入DNA,这些质粒为pKK2,pSa151、pTAVl、pTAVl00、pTAV200、pTAV201,PTAV202、pKT230、pKT231、pRK290、pSal51、pACYCl84和PBGSl8。比较了用电激制备细胞的方法。转化效率主要取决于质粒来源。用与辅助质粒PJB3JI接合的质粒PTAVl衍q二的质粒可获得最高转…     

α-乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中能加快啤酒成熟,有重要的应用价值。本研究将枯草芽孢杆菌启动子P43克隆到质粒pUC19-ALDC中的α-乙酰乳酸脱羧酶基因之前,得到重组质粒pUC19-P43-ALDC。重组质粒pUC19-P43-ALDC与质粒pMLK83-BN同源重组,筛选得到枯草芽孢杆菌整合质粒pMLK83-ALDC。用此整合质粒转化枯草芽孢杆菌1A751,挑选出新霉素抗性且无淀粉酶活性的重组菌株。此菌株用LB培养基在37℃、220r/min摇瓶培养过夜,测得α-乙酰乳酸脱羧酶活力为15.6U/mL,说明整合的α-乙酰乳酸脱羧酶基因能够在重组菌株中稳定传代和表达。本研究首次在枯草芽孢杆菌中用整合型的方式重组表达了α-乙酰乳酸脱羧酶,提出了一种有潜力的生产α-乙酰乳酸脱羧酶的新方法。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

利用PCR方法从酒类酒球菌(Oenococcus oeni)基因组中扩增出651 bp的DNA片段,将之克隆到pUC19-T载体上并转化大肠杆菌(E.coli)JM109菌株.重组质粒的测序结果表明,克隆到了苹果酸-乳酸酶基因(mle),它含有527 bp的阅读框架,其核苷酸序列与文献报道相同.     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

基因工程

940001乳酸克奋维酵母的电激转化〔英〕/San chez,M.…了Appl.Environ.Mierobiol‘一1993,59(7).一2057~2092〔译自DBA,1993,22(16),93-09071」 分析了与通过电激有效转化乳酸克鲁维酵母MDZ八有关的物理和生物学参数。利用最适电压并使小杯中的悬浮细胞体积恒定时,转化率随细胞数和质粒浓度的增加而提高。用二硫苏糖醇预处理上述酵母细胞能提高转化率。但是,最重要的参数是脉冲时间。1毫秒的改变可使转化率下降70~80%以上。在优化条件下,获得10“~107个转化体/协g质粒DNA。在一定条件下,质粒的大小也影响电激效果。在任何情况下,未获…     

对粉纹夜蛾高毒力cry9Eα基因的克隆及表达

[目的]从本实验室分离的Bt4菌株中克隆cry9Eα基因,并研究其表达和杀虫活性.[方法]以PCR-RFLP方法鉴定Bt4菌株含有cry9基因,然后以菌株Bt4的质粒为模板,利用全长引物F9EA/R9EA进行PCR扩增全长基因.[结果]将目的片段插入到表达载体pET21b,得到大肠杆菌重组表达质粒pETcrygEa.转化E.coli BL21(DE3),诱导后表达130 kDa的蛋白,再将cry9Eα7基因连接到穿梭载体pSXY422b,电激转化HD73-(cry-),得到工程菌BioHD9Ea7,提取Cry9Ea7晶体蛋白,并进行生物活性测定.生物活性测定结果显示CrygEa7蛋白对粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)初孵幼虫具有高毒力,LC_(50)为0.044 μg/mL,而对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫未显示活性.[结论]克隆和表达了一个对粉纹夜蛾高毒力的基因cry9Eα7,并成功构建了工程菌BioHD9Ea7.     

重组腺相关病毒介导的大鼠脂联素载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠脂联素基因(Acrp30),并对载有脂联素的重组腺相关病毒(AAV)载体进行构建及鉴定.方法:根据Acrp30的基因序列设计引物,上游引入EcoR Ⅰ位点,下游引入Sal Ⅰ位点,以EX-A0242-M01-Acrp30为模板扩增目的基因.将Acrp30基因克隆入pUC19载体中,获得重组质粒pUC19-Acrp30.然后用EcoR Ⅰ与sal Ⅰ酶切pUC19-Acrp30及质粒pSNAV,回收酶切片段,T4DNA连接酶16℃过夜,转化大肠杆菌DH5a感受肽细胞,筛选阳性克隆获得pSNAV-Acrp30,EcoR Ⅰ/Sal双酶切鉴定,并行全基因测序.结果:PCR电泳及酶切鉴定表明,pSNAV-Acrp30重组成功,基因测序显示装入pSNAV质粒中的Acrp30基因正确.结论:脂联素病毒栽体成功构建,可以满足脂联素基因研究和治疗的需要.     

植物遗传工程

闻住作物改良中的应用: (1 J苏云金芽孢杆菌};。1 体蛋白基因(列表链示所有cry基因的分子量值、 产生菌株及昆虫专一性); (2)品体蛋白的作用 机制; (3)抗虫植物的基因工程(如用全长,平 截,修饰的或合成的cry基因转化转基因烟草、番 航、马铃薯、棉花、玉米、水稻、花椰菜、欧洲云 杉等); (4)待开发的项目。 (朱遐) 942550 水稻悬浮培养物的生长特性及电激后基因在完整细 胞中的瞬时表达[英3/Chaudhury,A.…∥J.P1一 ant Biochem.Biotechn01.一1994,3(1).一 9～13[译自DBA,1994,13(7),94—03961] 由来自成熟种子培养物的1月龄盾片衍生愈…     

质粒研究与载体构建

922365 甲基营养细菌中新质粒的鉴别[英]/Brenner,V.…∥Antonie Leeuwenhoek J.Microbiol.-1991,60(1).-43～48[译自DBA,1991,10(25),91-14504] 从50种甲基营养菌菌株(其中30种来自土壤)中筛选质粒DNA。用碱性清除溶菌物法从专性甲基营养型甲基单胞菌属(Methylomonas sp.)菌株R103a中分离出36kb质粒pIH36,并构建了其限制性图谱。检测了甲基杆菌属(Methylobacterium)桃红色色素的兼性甲基营养菌中的4种质粒;菌株R15d中的质粒plB200(200kb)和pIB14(14kb),菌株M17中的pWU14(14kb)和     

生物固氮

922582 光合同氮菌深红红螺菌人工DNA介导的遗传转化[英]/Fitzmaurice,W.P.…∥Arch.Microbiol.-1991,156(2).-142～144[译自DBA,1992,10(25),91-14770] 用CaCl_2、CaCl_2-PEG6000和冻融法,以载体质粒pSa4转化深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)VR2(一种天然的链霉素抗性突变株)。DNA浓度低时,转化频率呈线性增加,较高浓度时则达到饱和。在用抗生素筛选前,用对数生长早期和静止生长早期的细胞,1～2分钟热激、37℃、200mM CaCl_2、表达5小时的转化最佳。     

基因标记、转化、表达与检测

950857转化群母曹的简簟而有效的方法[英]/Elble,R./BioTechniques.一1992,13(1).一18～20仁译自D.BA,1992,11(17),92—09534] 这是经简化的醋酸锂方法,每份样品仅需2～3分钟的处理。无论酵母菌处于什么生长期都可被转化。从O.5ml培养液得到细胞团,加上lO声1载体DNA(100#g)和lpg转化DNA。加O.5ml PEG一醋酸钮一。Tris-EDTA缓冲液(pH 7|.5),然后在室温下过夜。从静止液底层取50#1混合物直接涂在选择平板上。每芦g质粒pCD4 DNA可使酿酒酵母菌株8534.8C的饱和培养物产生7800～24000个转化子。对数生长期产生的转化子数只比静止期…     

生物固氮

961070 腐生性固氮放射形土壤杆菌5D-1的遗传转化[俄]/Yablunenko,A.N.…//Genetika(Mascow).-1995,31(6).-778～783[译自DBA,1995,14(19),95-11503] 用质粒pVZ2361和染色体DNA(含有标记trp 、his 和卡那霉素抗性)转化腐生性固氮放射形土壤杆菌5D-1的转化率分别为10000/μg DNA和     

基因工程

卿1135利用甲醉的Aeetobaeter啡山a.uC.MB 58的启动子探针载体的构建咦1/sehroeder,R·…11 Actaaiotcchnol一1 989,9(3)一219一225降自DBA,1989,8(]9),89一11145〕 载体质粒pRsZ由于广寄主范围复制子质粒RSF 1010的存在,因而可用在上述醋杆菌或大肠杆菌,它提供启动子克隆的单一限制性位点及选择转化体的抗性标记.该载体是把质粒pUC19的EcoRI一sall多聚接头插人到用&oRI/sa江消化的质粒pMK一6中构建得到的.产生的抗卡那霉素质粒pRsl被克隆到质粒RSF!010的EcoRI位点上,并用来转化大瓜扦菌C 600.含杂交质粒克隆的选择在含Km和S…