小鼠金属硫蛋白突变体αα-cDNA在烟草中的表达及转基因烟草对Cd~(2+)抗性的提高

金属硫蛋白是一类小分子量的金属结合蛋白 ,有 β,α两个结构域 .用另一个 α结构域取代金属硫蛋白的 β结构域 ,得到突变体 αα.通过 PCR法在 αα- c DNA翻译起始密码子 ATG前加入植物偏爱的碱基组合 AACA,构建 Ca MV双 35S启动子驱动的 αα- c DNA植物表达载体 p GPTVd35S-αα,此载体以抗除草剂基因 ( bar)作为选择标记物 .用根癌农杆菌介导的叶盘法对栽培种烟草 NC89进行转化 .Southern和 Western印迹分析表明突变体αα- c DNA已整合进入烟草基因组并且可以正常表达 .Northern印迹结果显示突变体αα- c DNA在烟草根部的表达强于叶部 .烟草根、茎、叶Cd2 +含量分析表明 ,转基因植物与对照相比 ,Cd2 +更多地集中在根部 ,在一定程度上降低了叶片中的 Cd2 + 含量 .Cd2 + 抗性实验进一步证明突变体αα- c DNA的表达提高了转基因烟草对 Cd2 + 的抗性 :转基因烟草在 2 0 0μmol/L Cd Cl2 条件下生长正常 ,在 40 0μmol/Cd Cl2 培养基内也可以存活 .而 1 0 0μmol/L Cd Cl2 即成为对照烟草的致死剂量 .     

转金属硫蛋白αα突变体基因的矮牵牛对铅的抗性及积累的研究

利用农杆菌介导的方法将MT及αα基因导入矮牵牛中.转基因植株对铅(Pb)的抗性及吸收能力明显高于对照.转MT及αα基因的植株分别能在150及200 μmol/L Pb中正常生长，而对照只能在50 μmol/L Pb中正常生长.转MT及αα基因植株后代种子萌发与对照相比表现出明显的抗Pb优势.Pb的吸收实验表明转MT、αα基因的植株对Pb的吸收分别比对照提高了28%和35%.     

外源钙对镉胁迫下南美蟛蜞菊毛状根生长、抗氧化酶活性和镉吸收的缓解效应

为了探讨外源钙对重金属镉(Cd)缓解南美蟛蜞菊Wedelia trilobata毛状根毒害的生理机理,采用溶液培养法研究了重金属Cd单独及其与Ca组合对南美蟛蜞菊毛状根生长、抗氧化酶超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性及对Cd2+吸收的影响。结果表明,Cd≤50μmol/L时促进毛状根生长;高于100μmol/LCd则抑制其生长,使其侧根短小,根尖变褐或变黑。与对照相比,不同浓度Cd培养的毛状根POD活性、SOD活性和MDA含量都比对照明显提高,但高于100μmol/L Cd培养的毛状根可溶性蛋白含量均比对照降低。与仅添加200μmol/L或300μmol/L Cd的毛状根相比,Cd和10~30 mmol/L Ca组合培养可促进毛状根生长,使其主、侧根变粗;提高其可溶性蛋白含量;降低其MDA含量、POD活性及SOD活性。原子吸收分光光度法测定结果表明,南美蟛蜞菊毛状根能吸收和吸附重金属Cd2+,当Cd2+浓度为100μmol/L时毛状根对Cd2+的吸收量最大,而Cd2+浓度为300μmol/L时毛状根对Cd2+的吸附量最大。外源加入10~30 mmol/L Ca2+可显著减少毛状根对Cd2+的吸收和吸附,并可调节其抗氧化酶活性,降低其膜脂过氧化水平而解除重金属镉对毛状根生长的抑制或毒害。     

镉对平菇菌丝生长及同工酶表达的影响

采用液体培养研究了不同浓度镉（Cd）处理7d对平菇（Pleurotus ostreotus）菌丝体生长及其同工酶表达的影响.结果表明,50 μmol/L Cd处理对平菇菌丝生长抑制率为55.6%,2000μmol/L Cd为菌丝生长致死浓度.同工酶活性电泳图谱显示,Cd处理不仅改变酯酶（EST）、乳酸脱氢酶（LDH）、过氧化物酶（POD）和超氧化物岐化酶（SOD）同工酶带数,而且也影响各酶带的表达强度.50 μmol/L和100μmol/L Cd处理分别诱导出2条和3条新的POD同工酶带,而抑制一条分子量较大的POD酶带的表达,但明显增强总的POD活性.正常生长的平菇菌丝体LDH同工酶谱只出现2条酶带,50 μmol/L以下Cd处理不影响其同工酶的表达,100 μmol/L Cd处理组2条同工酶带均消失.50和100μmol/L Cd处理能够显著增强SOD活性,且诱导2条SOD同工酶表达.100μmol/L及其以下浓度Cd处理均能提高EST的活性,这可能具有加速细胞内酯类化合物水解而增加羧基的数量以螯合更多的游离Cd离子而解Cd毒的作用.Cd浓度在50μmol/L以下时,随着处理浓度的增加,对金属硫蛋白的诱导作用呈逐渐增强的趋势,而100 μmol/L Cd的诱导作用减弱.     

镉胁迫下杞柳对金属元素的吸收及其根系形态构型特征

采用水培方法,研究了杞柳(Salix integra)2个品种在0-90 μmol/L Cd处理下不同组织对Cd的吸收和积累规律,探讨了镉胁迫下杞柳根系形态学功能响应特征以及对矿质离子吸收的影响。结果发现,镉在杞柳2个品种不同组织的含量均表现为根>韧皮部>木质部>叶。2个品种地上部组织对镉的吸收和积累规律相似:在0-70 μmol/L Cd处理浓度范围内,随着溶液Cd浓度的增加,叶、木质部、韧皮部中镉的含量逐渐增加,到50 μmol/L时,镉在地上部组织的含量达到最高,当Cd处理浓度达90 μmol/L时,地上部各组织中Cd含量出现下降趋势。而2个品种根系对Cd的吸收则不同,"微山湖"品种在溶液Cd达70 μmol/L时,根系镉的积累量最大,在90 μmol/L时,根系Cd的积累量明显下降;"一枝笔"品种根系在0-90 μmol/L范围内,根系Cd的积累量均为增加趋势。通过分析2个品种根系形态学参数变化发现,Cd胁迫抑制了杞柳2个品种根的伸长,促进了"微山湖"品种根的径向生长,导致根系平均直径增加;进一步对叶片矿质营养状态分析发现, Ca、Mn的吸收受镉胁迫的影响较大,在高浓度镉胁迫下(50-70 μmol/L)"微山湖"和"一枝笔"对Ca和Mn的吸收明显下降;Cd胁迫对Fe在叶片的含量影响不明显;同时发现,在50 μmol/L Cd处理下,Cu²⁺在叶片的积累明显增加。由此可见,杞柳2个品种间对镉的吸收和积累差异主要体现在根系,地上部对镉毒害的响应差异不大。     

转金属硫蛋白及其突变体αα基因烟草的T1代性状分析

转金属硫蛋白MT及其突变体αα的烟草自交得到T1代,转基因植株的重金属抗性和除草剂抗性在后代中得到保持,不同的转基因株系在含有除草剂的培养基中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数。两种转基因烟草在含有不同浓度Cd的培养基中萌发时表现出高的重金属抗性,其中转αα基因烟草对Cd的抗性优势在T1代种子萌发实验中更加明显。以MT cDNA为探针进行Southern blot杂交,在T0代和T1代同时检测到两种转基因烟草外源基因的存在,证明外源基因确实整合到烟草基因组内并稳定传递到后代。Western blot结果证明了外源基因在烟草第二代的表达,纯合株系仍需要进一步的筛选。     

镉及其与钙组合对褐脉少花龙葵毛状根生长、抗氧化酶活性和吸收镉的影响

为了探讨利用褐脉少花龙葵毛状根来修复重金属镉(Cd)污染的可能性,采用溶液培养法研究了Cd单独及其与钙(Ca)组合对褐脉少花龙葵毛状根生长、抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性及对Cd吸收的影响。结果表明,Cd≤50μmol/L时能促进毛状根生长,而高于100μmol/LCd则抑制毛状根生长,使其侧根根尖变褐和变短,数目减少。与对照相比,不同浓度Cd培养的毛状根可溶性蛋白含量和SOD活性先升高后逐渐下降;其丙二醛(MDA)含量显著提高;100μmol/LCd使毛状根POD活性逐渐升高,但300μmol/LCd则使毛状根POD活性逐渐降低。与对照(仅添加100μmol/L或300μmol/LCd的毛状根)相比,Cd和10～30mmol/LCaCl2组合培养使毛状根可溶性蛋白含量和MDA含量降低;但提高其SOD活性;而100μmol/LCd和10～30mmol/LCaCl2结合培养的毛状根POD活性均比对照低;而300μmol/LCd和10～30mmol/LCaCl2结合培养的毛状根POD活性则均比对照提高。原子吸收分光光度法测定结果表明,毛状根吸收和吸附的重金属Cd含量随着培养基中Cd浓度的升高而增加。但外源加入10～30mmol/LCaCl2能减少毛状根对Cd的吸收,并调节其抗氧化酶SOD和POD活性,降低其膜脂过氧化水平而解除重金属Cd对毛状根生长的抑制或毒害。     

不同耐性水稻幼苗根系对镉胁迫的形态及生理响应

采用水培试验,以两个耐镉性不同的水稻品种为材料,研究了不同浓度镉胁迫对水稻幼苗根系形态、根系活力、游离脯氨酸含量及抗氧化酶活性的影响。结果表明:低于5 μmol/L Cd胁迫对2个水稻品种总根长、根表面积、根体积、根干重、根系活力无明显影响,在1 μmol/L Cd时,甚至起促进作用。随Cd浓度增加表现出一定的抑制效应,秀水63在10 μmol/L Cd胁迫下根系形态、根系活力明显受到抑制,而秀水09在25 μmol/L Cd胁迫下明显受抑。随Cd胁迫浓度的增加,游离脯氨酸含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性均呈上升趋势,两品种相比,秀水09的游离脯氨酸含量、SOD和POD增幅大于秀水63,而MDA含量增幅小于秀水63;过氧化氢酶(CAT)活性变化表现为先上升后下降,10-100 μmol/L Cd胁迫下秀水63根系中CAT活性明显低于秀水09。总之,水稻对Cd毒害响应存在明显的品种差异,且Cd胁迫下根系生理响应的差异是品种间耐性差异的重要原因之一。     

转金属硫蛋白aa突变体基因的矮牵牛对铅的抗性及积累的研究

利用农杆菌介导的方法将MT及aa基因导入矮牵牛中,转基因植株对铅（Pb）的抗性及吸收能力明显于对照,转MT及aa基因的植株分别能在150及200μmol/L Pb中正常生长,而对照只能在50mol/L Pb中正常生长,转MT及aa基因植株后代种子萌发与对照相比表现出明显的抗Pb优势,Pb的吸收实验表明转MT、aa基因的植株对Pb的吸收分别比对照提高了28％和35％。     

转金属硫蛋白基因(MT_1)烟草耐NaCl胁迫能力

为明确柽柳(Tamarix sp.)金属硫蛋白(MT1)基因过量表达对提高植物耐NaCl能力的作用,对转MT1因烟草进行分子检测和生理特性分析,结果表明具有卡那霉素抗性的转基因植株经RT-PCR Southern杂交均表现为阳性,说明外源MT1基因已整合到烟草基因组,并且得到了表达。金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因烟草植株的耐NaCl能力,表现为在含有150mmol/L和300mmol/L NaCl的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株丙二醛(MDA)含量明显低于非转基因株系,而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性比非转基因株系明显增加。     

茉莉酸对水稻侧根发生的影响

实验材料为水稻 (OryzasativaL .)栽培品种“IR8”(国际水稻所 8号 )及其少侧根突变体MT10。将 2d水稻幼苗种子根全部浸入 0 .0 16～ 5 0 μmol/L茉莉酸 (JA)溶液处理 2d ,结果表明JA显著抑制种子根的伸长 ,其抑制程度与JA浓度成正比。不高于 2 μmol/L的JA显著促进侧根的发生 ,每cm的侧根数目随浓度的增加而增加 ,最多可增加到原来的 16 8% (“IR8”)和 2 85 % (MT10 )。 10 μmol/L的JA仍促进处理过程中和处理后生成根区段的侧根数目的增加 ,但明显抑制处理前生成根区段侧根的发生 ,每cm的侧根数目有所下降     

应用电击法获得转MT基因平菇

将MT基因用电击法转化平菇 (Pleurotusostreatus) ,MT基因表达蛋白与金属离子结合而形成络合物 ,用Zn诱导 ,转基因平菇能富集Zn ,可为缺Zn的人群补充Zn ,使平菇成为一种保健和治疗的食品或蔬菜。原生质体制备浓度为 6 .74 5× 10 6个 /mL。原生质体电击转化率为 0 .0 1%。PCR检测 ,2 0 0bp处有MT基因条带。蛋白检测 :转基因MT平菇ELISA检测阳性 ,表达率为 0 .6 %～ 0 .8%。SDS_PAGE显示有表达条带。Westernblot显示有阳性条带。抗ZnSO4结果 :野生型平菇抗ZnSO4浓度为 1.0mmol/L ,1.2mmol/L开始受抑制 ,转基因平菇抗ZnSO4浓度为 1.5mmol/L ,2 .0mmol/L开始受抑制。出菇试验结果表明 ,在米糠与锯沫比为 1∶3的培养基上生长 ,在米糠与锯沫比为1∶4的培养基上不生长。 2 4d菌丝可在广口瓶中长满 ,用于子实体培养。     

高浓度CO2下苦草的生长和生理生化反应

对沉水植物苦草 (VallisneriaspiraslisL .)在高浓度CO2 (10 0 0 μmol/mol)和对照浓度CO2 (35 0 μmol/mol)下的生长特征和生理生化指标进行了比较研究。在实验的早期阶段 ,从冬芽出苗的苦草幼株在高浓度CO2 下生长明显加快 ,但由于后期生长逐渐放慢 ,其最终总生物量比对照组仅高出 11.6 %。尽管高浓度CO2 也促进了根的生物量的累积 ,但是由于苦草叶片生物量占总株生物量比例大 ,高浓度CO2 下苦草生物量的增加主要反映为叶片生物量的增加。在实验后期阶段 ,高浓度CO2 促进了苦草冬芽的形成。实验过程中 ,苦草的根叶生物量比 (RLR)在高浓度和对照浓度CO2 下均有所降低 ,二者之间无明显统计学差异。高浓度CO2 下苦草叶片中叶绿素含量和可溶性蛋白质含量降低 ,而可溶性总糖含量明显增加。     

应用电击法获得转MT基因平菇

将MT基因用电击法转化平菇(Pleurotus ostreatus),MT基因表达蛋白与金属离子结合而形成络合物,用Zn 诱导,转基因平菇能富集Zn,可为缺Zn的人群补充Zn,使平菇成为一种保健和治疗的食品或蔬菜.原生质体制备浓度为6.745×106个/mL.原生质体电击转化率为0.01%.PCR检测,200 bp处有MT基因条带.蛋白检测:转基因MT平菇ELISA检测阳性,表达率为0.6%～0.8%.SDS-PAGE 显示有表达条带.Western blot显示有阳性条带.抗ZnSO4结果:野生型平菇抗ZnSO4浓度为1.0 mmol/L,1.2 mmol/L开始受抑制,转基因平菇抗ZnSO4浓度为1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L开始受抑制. 出菇试验结果表明,在米糠与锯沫比为1∶3的培养基上生长,在米糠与锯沫比为1∶4的培养基上不生长.24 d菌丝可在广口瓶中长满,用于子实体培养.     

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na /H 反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2·0mg/L6-BA、0·1mg/LIAA、1mg/LKT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株(转化频率为4·17%)。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na 及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K 的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。     

普通小球藻对不同浓度镉胁迫的生理应答

以普通小球藻(Chlorella vulgaris)为研究材料探讨不同镉浓度对小球藻生理生化特性的影响。研究结果表明: 在5—40 μmol/L的Cd2+胁迫下, 普通小球藻的蛋白质、多糖和叶绿素含量均表现为随着Cd2+浓度的增加呈现逐渐增加的趋势, 30 μmol/L略高于对照组后又逐渐降低; 小球藻细胞中SOD活性及过氧化氢(H₂O₂)含量表现出先增加后减弱的趋势, 35 μmol/L时达到最大; 而小球藻中MDA含量随着Cd2+浓度的升高一直增加。这说明在重金属镉胁迫下小球藻会通过不同的生理应答来维持自身的正常生长代谢。     

茉莉酸对水稻侧根发生的影响

实验材料为水稻(Oryza sativa L.)栽培品种"IR8"(国际水稻所8号)及其少侧根突变体MT10.将2 d水稻幼苗种子根全部浸入0.016～50 μmol/L 茉莉酸(JA)溶液处理2 d,结果表明JA显著抑制种子根的伸长,其抑制程度与JA浓度成正比.不高于2 μmol/L的JA显著促进侧根的发生,每cm的侧根数目随浓度的增加而增加,最多可增加到原来的168%("IR8")和285%(MT10).10 μmol/L的JA仍促进处理过程中和处理后生成根区段的侧根数目的增加,但明显抑制处理前生成根区段侧根的发生,每cm的侧根数目有所下降.     

重金属镉及其与锌组合对黄瓜毛状根生长及其抗氧化酶活性的影响

为了探讨利用黄瓜毛状根来修复重金属镉(Cd)污染的可能性, 研究了重金属Cd单独及其与锌(Zn)组合对黄瓜毛状根生长及其抗氧化酶SOD、POD活性变化的影响。结果表明, Cd≤10 mg/L仅在培养5~15 d间促进黄瓜毛状根生长, 使根增粗; 而Cd≥15 mg/L则抑制黄瓜毛状根生长, 浓度愈高抑制作用愈明显, 侧根变得短而细小。在供试的不同浓度Cd培养的黄瓜毛状根中, 除10 mg/L Cd外, 其余Cd浓度培养的黄瓜毛状根可溶性蛋白含量随着培养时间的延长而逐渐下降; 但其POD和SOD活性则随着培养时间的延长而逐渐升高。与对照(仅添加25 mg/L Zn)相比, 仅1 mg/L Cd+ 25 mg/L Zn组合在培养7~15 d期间促进黄瓜毛状根生长; 其余浓度Cd和25 mg/L Zn组合都抑制黄瓜毛状根的生长, 且Cd浓度愈高抑制作用越强, 侧根数目更少且短小, 侧根根尖变得肿胀; 同时, 除培养5 d外, 25 mg/L Zn和不同浓度Cd组合培养的黄瓜毛状根的生物量、POD和SOD活性均比单独添加对应浓度Cd培养的毛状根降低, 但其可溶性蛋白含量则较之明显提高。结果表明: 黄瓜毛状根具有较强的重金属Cd耐受能力, 高浓度Cd则抑制其生长; 而镉和锌组合会随着培养时间的延长而加重Cd对黄瓜毛状根生长的抑制作用。     

Cd2+对紫球藻生长及光化学活性的影响

以紫球藻(Porphyridium purpureum)为供试材料, 研究了5个不同浓度的Cd2+对紫球藻的细胞密度、叶绿素a含量、藻红蛋白含量及ATP含量的影响, 以及对紫球藻的最大光量子产额(F_v/F_m)、实际光量子产额(YII)、相对电子传递效率(ETR)及非光化学淬灭(NPQ)的影响, 探讨了各荧光参数在不同浓度的Cd2+胁迫下的变化规律。研究结果表明, 在Cd2+胁迫的6d内, 紫球藻的生长速度显著下降, 且Cd2+的浓度越高, 生长速度下降越快; Cd2+胁迫显著的减少叶绿素a、藻红蛋白及ATP含量, 且浓度越高, 减少的幅度越大; 在Cd2+浓度低于200 μmol/L时, 紫球藻的叶绿素荧光参数F_v/F_m、YII及ETR呈现先下降后上升的趋势,而且随着胁迫时间的延长, 下降幅度逐步增大; NPQ在低浓度下(<200 μmol/L)呈现显著上升趋势, 高浓度下(>500 μmol/L)呈现显著下降趋势。因此, 水体中浓度超过50 μmol/L的Cd2+就会显著影响紫球藻的生长及光化学活性, 水生环境中不断累积的Cd2+将会对紫球藻的生态平衡产生影响。     

早熟禾对4种重金属胁迫生长响应特征

采用砂培法研究了早熟禾对不同浓度Cu2 、Zn2 、Cd2 和Pb2 胁迫的生长响应特征.结果表明,当Cu2 、Zn2 、Cd2 的浓度达100 m g/L时,早熟禾的种子萌发率、幼苗株高均有所下降,并随着胁迫浓度的增加,下降幅度增大;Pb2 对两指标的影响不太明显.Cu2 对根系及地上生物量具有抑制作用,尤其对根系生长抑制效应极为明显,当浓度增加到600 m g/L时,与对照相比,根长最高下降了96.67%.Zn2 、Cd2 和Pb2 在浓度超过200 m g/L时对早熟禾根系及地上生物量表现出抑制效应,并随着浓度的增加抑制效应增加.4种重金属对叶绿素的影响表现出一致的规律,即当浓度小于200 m g/L时对叶绿素的合成起促进作用,当浓度超过200 m g/L时,叶绿素的含量又随着处理浓度的增加而下降.