实验动物组织血管铁质反应与胶原、弹性纤维和肌纤维的组合染色法

在进行实验动物组织染色反应中,为了证明血管铁质物质与胶原、弹性纤维和肌纤维的分布情况,选用丽春红S苦味酸(Ponceau S picric acid)、间苯二酚碱性复红(Resorein basic fuchsin)与Perls铁法(简称P-PA-R-BF-P法),对大鼠组织进行组合染色,能够较好显示组织血管中铁质物质与胶原、弹性纤维和肌纤维,铁质物质呈蓝色,胶原纤维呈红色,弹性纤维呈棕色,肌纤维呈黄色。这是一种相互对比清晰的组合染色方法。     

制作实验动物组织切片的质量控制

实验动物组织制片要比人体组织制片有一定难度,这是动物组织的性质和特点,因此我们多年来为了解决制片质量问题,而从动物的的固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包理和染色环节中,进行了系列性反复实验,已形成了完整的动物制片改进方法。此法适用于大批动物组织制片质量的控制,是目前较为理想的动物制片方法。材料和方法一、组织固定与取材的方法:本室选用12%中性甲醛固定液,动物解剖时候,将各     

GST pull-down联合质谱筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质北大核心CSCD

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex 1,BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用Bio GPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO(gene ontology)富集分析。本实验共筛选出108个(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

铊激活人红细胞膜(Na~ -K~ )-ATP酶研究

铊是Ⅲ族元素,放射性药物铊(~(201)TI)对心肌组织有一定亲和性。近十多年,日趋广泛地应用于临床心肌灌注显影,诊断心肌疾患,效果较好。但它由细胞转运而为细胞摄取、组织浓集的机理至今未被阐明。本工作是在研究完整细胞摄取T1~ 规律、机理的基础上,进一步探讨T1~ 的细胞膜转运和(Na~ -K~ )-ATP酶(Na泵)之间的联系,用人红细胞膜为材料,比较研究T1~ 和K~ 激活人红细胞膜(Na~ -K~ )-ATP酶的异同。一、材料和方法 (Na~ -K~ )-ATP酶是细胞膜上一横贯质膜的固有蛋白。我们用人红细胞膜作为粗制的(Na~ -K~ )-ATP酶。在适当条件下,用酶分解底物而产生的无机磷量(Pi)来衡量酶活性,比活性单位为μmolePi.mgP~(-1).hr~(-1),其中mgP是单位重量红细胞膜蛋白量。本实验用血取自同     

神经细胞尼氏体和神经髓鞘的双重组合染色法与应用

探讨了显示实验动物脊髓组织中的神经尼氏体和神经髓鞘等组织成分的双重组合染色法,通过分别选用孔雀石绿(Malachite green)和橙黄G、磷钨酸(Orange G,Phosphotungstic acid)组合染色(简称MG-OP法)。已能够显示狗脊髓神经尼氏体呈绿色,细胞核呈黄色。神经纤维髓鞘轴突呈黄色,神经膜和结缔组织纤维呈绿色,背景呈淡黄色。MG-OP法克服了原法成分单一,色彩效果差,所建立的双重组合染色法,对比清晰,色彩鲜艳,方法简便的较好染色方法。     

高分子人工血管材料大鼠肌肉内的急性期反应

本实验研究临床常用的几种人造血管生物材料在大鼠体内引起的急性期组织反应,并与自主研发的丝素蛋白改性聚氨酯(Silk fibroin-polyurethane(1:1),SF-PU(1:1))材料相比较,以期找出组织相容性最佳的材料。将涤纶(Dacron)材料、膨化聚四氟乙烯(Expanded polyterafluoroethylene,e-PTFE)材料、聚氨酯(Polyurethane,PU)材料、以及丝素蛋白改性聚氨酯复合材料(SF-PU(1:1))埋植入大鼠肌肉内,通过大鼠急性毒性实验、肌肉植入局部组织反应实验、局部组织切片染色、白细胞及血小板计数,探讨几种材料对大鼠的局部及全身影响,研究比较各组材料的组织相容性。结果表明:涤纶材料的组织相容性较差;其余各组材料的局部组织炎性反应较轻,且白细胞及血小板计数与假手术组无显著性差异。故认为涤纶作为临床上常用的人造血管材料组织相容性最差,所研发的SF-PU(1:1)材料及另两种临床上常用的e-PTFE材料和PU材料的组织相容性较好,尤以SF-PU(1:1)材料的组织相容性最好,结合SF-PU(1:1)优异的物理性能,在小口径人造血管的研制方面有很大的研究前景。     

显示弹性,胶原纤维的双重组合染色法

在特殊染色中,分别显示胶原纤维和弹性纤维的方法较多,但是这二种染色效果较差,多年来为了使动物和人体组织中能同时可靠的显示胶原和弹性纤维成分,并在较长时间内不褪色。为此我们进行了反复的实验性研究,在选用多种染料中,发现酸性染料 Ponceau S(丽春红 S),碱性染料Victoria blue(维多利亚蓝)等试剂,经过重新组合后,能更好的显示胶原纤维呈红色,弹性纤维呈蓝绿色,肌肉等呈黄色,染色色彩鲜艳,对比清晰。其方法简单,容易掌握,这是一种较为理想的双重组合染色方法。     

大叶钩藤中非生物碱成分对骨肉瘤细胞增殖的影响

大叶钩藤 (ＵｎｃａｒｉａｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａＷａｌｌ.)系茜草科钩藤属植物 ,为常用中药 ,用于治疗头晕目眩、惊痫抽搐、全身麻木等疾病。现已成为治疗高血压方剂中的常用药物[1] 。其化学、药理及应用有较多研究 ,但绝大部分是针对生物碱部分 ,非生物碱部分作为无用成分而极少研究和应用。为了明确其药理作用的物质基础及进一步挖掘其药用潜能 ,作者在对大叶钩藤的非生物碱部分进行系统研究的基础上[2 ] ,对抗肿瘤活性进行研究。1　材料与方法1 1　实验材料实验样品乌索酸 (Ⅰ )、3β 6 β 2 3 三羟基乌索酸 (Ⅲ )、表儿茶素 (Ⅳ )、…     

梅花鹿重组Galectin-1的表达及多克隆抗体的制备与鉴定

半乳糖凝集素-1（Galectin-1）是最先被报道的哺乳动物半乳糖凝集素,存在于多种组织和细胞内,参与细胞的粘附、增殖、凋亡和炎症反应等多种生理病理过程,并且与免疫系统的调节和肿瘤的发生发展密切相关。鹿茸是哺乳动物中罕见的能够周期性的脱落和再生的附属器官,作为研究哺乳动物器官再生的新模型受到关注。鹿茸再生是一个基于干细胞的过程,定位于角柄骨膜的干细胞是鹿茸再生的基础,Galectin-1在角柄骨膜细胞（pedicle periosteum cell, PPC）中高度表达,提示其在鹿茸再生中发挥着重要的作用。由于尚没有商用的鹿Galectin-1蛋白及其抗体,为进一步研究Galectin-1在鹿茸再生中的生物学功能,需要制备相应的蛋白和抗体,本实验将梅花鹿Galectin-1基因与pET28a连接,并将重组质粒pET28a-Galectin-1转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中诱导表达。用Ni-NTA Agarose亲和层析纯化融合蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体。酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法检测抗体效价、Western blot 检测抗体特异性、细胞免疫荧光检测Galectin-1在角柄骨膜细胞中的表达情况。结果表明,本实验成功诱导重组原核表达载体pET28a-Galectin-1在BL21(DE3)中表达,通过Ni纯化获得融合蛋白。ELISA结果显示,抗体效价达到1:64000,Western blot结果表明该抗体特异性良好,细胞免疫荧光显示Galectin-1在PPC全细胞中表达。本实验获得了纯化的鹿Galectin-1蛋白和特异性较好的多克隆抗体,为揭示Galectin-1在鹿茸再生调控中的作用提供了重要的实验材料。     

运动性和高血压性心肌肥大大鼠血浆生物活性肽含量变化的对比研究

探讨内皮素 (ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ,ＥＴ)、降钙素基因相关肽 (ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ ,ＣＧＲＰ)、神经肽Ｙ(ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ,ＮＰＹ)等生物活性肽在运动性和病理性心肌肥大形成中的调节作用目前尚未见资料报道 ,因此 ,本课题具有重要意义。1　材料和方法(1)材料与药品　选用ｗｉｓｔａｒ雄性大鼠 30只 ,体重 2 40～ 32 0 ｇ ,随机分为 3组。动物室内温度 17～ 2 3℃。放免试剂均由北京东亚免疫技术研究所提供。(2 )实验动物模型的建立　①运动组 :ｗｉｓｔａｒ大鼠 9只 ,先进行 3天适应性训…     

GST pull-down联合质谱筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质

（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1（dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1）是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome related organelles complex 1, BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽 琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱（LC MS/MS）分析筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用BioGPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO（gene ontology）富集分析。本实验共筛选出108个（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

显示DNA的改良染色在图象分析系统中的应用

在人体和动物组织中的核酸染色技术应用较为深入，通过图象分析系统对ＤＮＡ含量测定，而提供了可靠的依据。为了能够使ＤＮＡ组化染色技术，更好的适应图象分析系统的定量研究需要，因此我们对显示ＤＮＡ的染色方法进行了实验对照研究。选用在室温下的高浓度盐酸对细胞水解充足作用，而得到较好效果。改进了Ｓｃｈｉｆｆ＇Ｓ染色液配制，减少染色时间和程序，结果证明了染色稳定可靠，色彩对比度较强，适用于图象分析系统的应用。     

介绍几种理想的生物实验材料

选用理想的生物实验材料是保证实验效果的重要条件 ,本人在实践中摸索了几种实验的理想材料 ,现介绍如下。1　光合作用的条件和产物本实验用一串红 (串红 )的叶作材料效果好。将盆栽一串红先饥饿一夜之后 ,取成对的黑片将所选的一串红叶的一部分上下相对夹住 ,随即对其进行光照 3h左右 ,此叶便可摘下 ,撤掉黑片 ,将其放入隔水加热的酒精液中脱色 ,然后将其取出放到清水中漂洗后再用碘酒染色 ,此叶便可出现理想的实验结果。本实验进行时节正值一串红 (串红 )生长旺盛期 ,它分叶多 ,而且叶的颜色很绿 ,它的老叶、成叶及新叶都可用于实验且见效…     

红色红曲霉Mr-1的次级代谢产物生物活性成分分析

【背景】红曲霉(Monascus)是一种重要的药食同源性真菌,其自身产生的次级代谢产物具有多种生理活性功能,然而红曲霉中的生物活性成分却鲜有报道。利用红曲霉发酵液进行药效物质成分追溯,对了解红曲霉药效物质基础具有十分重要的意义。【目的】对红色红曲霉(M.ruber)Mr-1次级代谢产物中的生物活性成分和生物学功能进行研究。【方法】采用硅胶柱、SephadexLH-20凝胶柱等色谱技术对活性成分进行分离纯化,通过核磁共振和高分辨质谱技术对化合物结构进行解析;对鉴定的化合物进行体外抗氧化、抑菌和酶活性测定。【结果】从红色红曲霉Mr-1次级代谢产物中分离得到4个活性化合物,鉴定为3个黄酮类化合物Luteolin(1)、Hesperetin(2)、Glycitein(3)和1个萜类化合物Ursolic acid(4)。化合物1、2、4为首次从红曲菌科中分离得到。在抗氧化试验中,化合物1对ABTS⁺、DPPH和OH^-自由基具有较强的清除能力,IC₅₀分别为13.36、8.74和32.75μg/mL;在抑菌试验中,化合物4对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和李斯特菌(Listeria monocytogenes)表现出中等强度的抑菌能力,抑菌圈直径分别为13.4 mm和11.9 mm;在α-葡萄糖苷酶抑制活性试验中,化合物4表现出很强的抑制能力,IC₅₀为21.34μg/mL。【结论】红色红曲霉Mr-1是宝贵的微生物种质资源,其产生的次级代谢产物生物活性成分多样,具有开发成功能性食品原料的潜能。     

斑马鱼窖蛋白-1基因cDNA克隆及功能初步研究

窖蛋白-1(Cav-1)是胞膜窖的主要结构蛋白, 可与多种信号分子相互作用, 调节细胞的增殖、分化和凋亡, 其异常表达与多种人体疾病的发生和发展密切相关, 而在斑马鱼发育中的功能尚不很清楚。研究克隆出斑马鱼窖蛋白-1基因两个亚型的全长cDNA, 与其他物种窖蛋白-1的氨基酸序列进行比较, 发现该蛋白在脊椎动物中非常保守。利用逆转录多聚酶链反应检测发现, 在斑马鱼多个成年组织中窖蛋白-1的两个亚型均有转录表达。利用胚胎整体原位杂交检测组织或器官特异基因的时空表达变化发现, 过表达或利用Morpholino反义寡聚核苷酸(MO)抑制cav-1α的表达可影响脊索和体节的发育, 而过表达或MO抑制cav-1β可导致肝脏发育的异常;此外, 过表达或MO抑制cav-1α或-1β均可影响斑马鱼神经系统的发育。因此, 斑马鱼Cav-1在维持组织器官的生理功能和调控胚胎的正常发育中起着重要作用。       

皮肤组织显微共聚焦拉曼光谱成像研究

显微共聚焦拉曼光谱成像技术(Confocal Raman Microspectroscopy Imaging,CRMI)能够对样品微区进行精确无损的拉曼光谱分析和光谱图像扫描,提供生物样品的无损高分辨光学信息。本项研究工作,利用CRMI技术实验获取了正常人体离体皮肤组织的拉曼光谱特征,并结合典型特征峰的扫描图像,探讨了脂类、蛋白质等成分在皮肤真皮层的分布特点。实验发现皮肤组织真皮层内胶原蛋白的拉曼特征峰1 248 cm-1强度及其空间分布尤为突出,这一实验结果与组织学中胶原纤维占真皮结缔组织95%的事实相符。实验结果显示,CRMI技术能够全面诠释生物组织内部生化组成与分布信息,在实验描述皮肤组织病理变化的分子生物学机制方面具有广阔的应用前景。     

基于网络药理学和分子对接探索桑白皮治疗糖尿病周围神经病变的潜在机制

本研究运用网络药理学和分子对接方法对中药桑白皮治疗糖尿病周围神经病变(DPN)的活性成分、潜在作用靶点和信号通路进行研究,探索桑白皮治疗DPN的可能作用机制。首先从中药系统药理学数据库(TCMSP)筛选出桑白皮的活性成分及靶点基因。通过GeneCards数据库及OMIM数据库筛选出DPN的疾病靶点基因,并用Cytoscape软件构建“药物-有效成分-靶基因-疾病”中药调控网络图。将有效成分靶标与疾病靶标上传到STRING数据库,构建蛋白互作网络图(PPI),并使用R语言对得到的PPI进行核心基因的筛选。运用R语言对关键靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其次从活性成分及靶点基因中根据degree值筛选出前3个关键成分,并将该网络中的基因靶点以degree值高低进行排序,选择前3个核心靶点,然后从RCSB数据库下载相关蛋白的结构,使用Pymol软件去除溶剂分子与配体,使用AutoDock软件进行分子对接。最后通过酶联免疫吸附实验和荧光光谱实验验证网络药理学富集分析的结果。最终预测到31个桑白皮活性成分,312个活性成分相关靶点,120个桑白皮-糖尿病周围神经病变共同有效靶点。活性成分中度值最高的为槲皮素,其次为山柰酚。PPI网络核心基因为转录因子AP-1(JUN)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、转录因子p65(RELA)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白介素6(IL-6)等;GO富集分析显示会影响基因的转录、细胞因子表达和蛋白激酶活性等;KEGG通路富集分析显示AGE-RAGE信号通路、流体剪切力和动脉粥样硬化为显著性最高的通路,其次为卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、MAPK信号通路、人巨细胞病毒感染、TNF信号通路。分子对接结果显示关键成分中槲皮素与对应靶点具有较好的结合活性。酶联免疫吸附实验提示桑白皮能够降低IL-6和TNF-α的表达,荧光光谱实验证实桑白皮能够减少AGEs。可见中药桑白皮治疗糖尿病周围神经病变具有多成分、多靶点、多功能、多通路的作用特点,其潜在的作用机制可能与AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等有关。     

改良染色显示中国对虾病毒核酸DNA

对虾病毒病的诊断 ,只根据患病对虾群体的表现症状 ,是不能确诊的。目前最基本又广为采用的诊断技术是通过组织病理检查来找到病毒包涵体 ,或应用细胞病理技术在电子显微镜下观察到病毒颗粒。在组织切片检查中 ,对虾病毒核酸 DNA的 Schiff's反应已有报道。但对于稳定可能的快速显示对虾病毒 DNA成分的改良染色技术还未见报道。我们采用龚志锦等 (1994 )研究的改进染色液配制方法 ,首次进行中国对虾病毒核酸DNA显示实验 ,得到了较好的 DNA染色结果。1　材料与方法1.1　材料选用　取患病或室内感染的中国对虾 ,分别进行冰冻切片和 3种不…     

微波修复抗原和微波酶消化法同时应用在P16和CyclinD1免疫组织化学方法中的体会

Ｐ１６蛋白和ＣｙｃｌｉｎＤ１是两种常用的抗细胞周期调控因子抗体,Ｐ１６是多种肿瘤抑制基因的表达产物,ＣｙｃｌｉｎＤ１是一种癌基因产物,在肿瘤病理学研究中选用Ｐ１６和ＣｙｃｌｉｎＤ１等作为相反的抗体是十分有意义的［１］。为提高这两种抗体在石蜡包埋切片中的阳性检出率,我们在实验操作中同时应用了微波抗原修复法和微波胰蛋白酶消化法,获得了较为满意的结果,现报道如下：１　材料和方法１１　材料：选取本科手术切除大肠腺癌标本存档蜡块４０例,每例均切６张４μｍ切片备用,切片裱于涂有防脱片剂的干净载玻片上。１…     

家蝇cDNA文库的构建

自Ｂｏｍａｎ小组 (Ｓｔｅｉｎｅｒ ,1981)从惜古比天蚕(Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａｃｅｃｒｏｐｉａ)中分离、纯化出第一种抗菌肽天蚕素以来 ,人们已在昆虫和其他无脊椎动物中发现了 170多种抗菌肽 (Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ ,1999)。目前 ,人们不仅搞清楚了多数抗菌肽的氨基酸序列、结构和功能特点 ,而且还对一些抗菌肽的基因进行了克隆 (陈留存和王金星 ,1999)。我们以家蝇为材料 ,分离、纯化出了抗菌肽 ,在此基础上 ,构建了经过诱导的家蝇ｃＤＮＡ文库 ,以克隆其基因。1　材料和方法1 1　实验材料家蝇 (Ｍｕｓｃａｄｏｍｅｓｔｉｃａ)…