普城沙雷氏菌splI及spsI基因突变株的构建

普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)G3分离自小麦内茎,是一种可产生多种抗菌因子和植物激素的内生细菌。目前对S.plymuthica G3的两个群体感应系统splI/splR与SpsR/SpsI的了解仍十分有限。构建了2个N-乙酰基高丝氨酸内酯信号合成酶编码基因splI和spsI突变菌株及互补菌株,并检测了其生物表型。结果发现spsI、splI突变后,对细菌信号分子合成有一定的影响,蛋白酶活性明显降低。通过对突变体和互补菌株的泳动性分析发现,splI负调控G3的运动性,而spsI正调控G3的运动性。     

粘质沙雷氏菌AS-1中SpnR功能及卤化呋喃对其群体感应的抑制

通过分泌和感知一系列信号分子,细菌能够根据自身菌体密度的变化调控基因的表达,从而控制一系列重要的表现型,包括毒力因子的产生,生物膜的形成以及菌体发光等.这种广泛存在的信号机制被称为群体感应.在沙雷氏菌种中已经发现了多套群体感应机制.粘质沙雷氏菌AS-1从土壤中分离,其中含有LuxI/LuxR的同类蛋白,被称为SpnI/SpnR.粘质沙雷氏菌AS-1合成AHLs分子N-hexanoy1-L-homoserinelactone(C6-HSL)和N-(3.oxohexanoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C6-HSL)作为其信号分子,通过群体感应感知菌体密度来控制基因的表达.通过基因替代的方法制得了spnR基因破坏的变异株,命名为粘质沙雷氏菌AS-1R.对粘质沙雷氏菌AS-1R的研究表明SpnR蛋白消极的调控沙雷氏菌红色色素的产生,运动性以及生物膜的形成等一系列由群体感应控制的性状:另一方面,作为一种天然的群体感应抑制剂,卤化呋喃能够有效的抑制粘质沙雷氏菌AS-1的群体感应,但并不干扰AHL-SpnR的相互作用.为运用粘质沙雷氏菌群体感应调节抑制其致病性提供了方法和依据,同时也为卤化呋喃对群体感应抑制机理的研究提供了新的思路.     

粘质沙雷氏菌杀虫试验

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)属沙雷氏菌族,也称灵菌,是昆虫的一种病原菌,能感染许多昆虫的幼虫和成虫。国外早有研究,然而作为水稻害虫病原菌加以研究,尚未见到报道。近年来我们在这方面做了一些工作,分述如下。     

东亚飞蝗病原褪色沙雷氏菌的分型分析

对东亚飞蝗的致病性菌褪色沙雷氏菌进行分型研究,为东亚飞蝗的生物学防治研究或可构建基因工程菌的候选菌株。利用血清型分型与脉冲场凝胶电泳分型方法对不同地区及个体的病死蝗虫中分离的10株细菌与模式菌株(ATCC 13880)进行了分析。结果显示,由不同地区及个体中分离得到的褪色沙雷氏菌同源性存在差异性,基因分型相似性在64%~100%之间,存在不同程度的亲缘关系。本试验丰富了褪色沙雷氏菌的生物学性状内容,也为对褪色沙雷氏菌的检验与进一步深入研究提供了具有参考价值的资料。     

沙雷氏菌抗生性次级代谢产物合成机制

沙雷氏菌(Serratia)是一类重要的生防菌,能分泌多种抗生性代谢产物,如灵菌红素、脂肽、碳青霉烯、几丁质酶、异硫霉素、硝吡咯菌素、水解酶、大环内酯类抗生素、嗜铁素等,从而抑制不同植物病原真菌的生长。总结了沙雷氏菌中已报道的抗生性次级代谢产物生物合成机制,重点阐述了次生代谢产物的功能、合成途径等的新进展,同时对沙雷氏菌在生物防治中的应用和其作为生防菌剂的前景进行展望。     

粘质沙雷氏菌氯霉素抗性基因的克隆及其性质分析

通过构建粘质沙雷氏菌KMR-3菌株的基因组DNA文库, 克隆到了与该菌的氯霉素抗性相关基因, 并对其部分特性进行了初步研究。结果表明: 克隆到的氯霉素抗性基因所编码的蛋白属于PRK10473蛋白, 由397个氨基酸编码, 与变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans 568) Bcr/CflA亚家族药物抗性转运蛋白同源性最高, 达到92%, 并对该基因的调控序列(启动子、终止子、SD序列及转录起始位点) 进行了分析。     

粘质沙雷氏菌氯霉素抗性基因的克隆及其性质分析

通过构建粘质沙雷氏菌KMR-3菌株的基因组DNA文库, 克隆到了与该菌的氯霉素抗性相关基因, 并对其部分特性进行了初步研究。结果表明: 克隆到的氯霉素抗性基因所编码的蛋白属于PRK10473蛋白, 由397个氨基酸编码, 与变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans 568) Bcr/CflA亚家族药物抗性转运蛋白同源性最高, 达到92%, 并对该基因的调控序列(启动子、终止子、SD序列及转录起始位点) 进行了分析。     

粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的研究进展

几丁质酶具有降解几丁质的作用,其降解产物氨基寡糖和几丁低聚糖在农业、食品、医药等领域具有重要的应用价值和广泛的应用前景。自然界中多种微生物可以产生几丁质酶,而其在细菌体内的合成受精密调控。粘质沙雷氏菌作为一种高产几丁质酶的菌种,在农业生防领域具有很大的应用潜力。本综述从粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的分类和结构特征、几丁质酶基因克隆、表达和调控以及几丁质酶的应用等方面论述了粘质沙雷氏菌几丁质酶基因的研究进展,为粘质沙雷氏菌几丁质酶基因和功能蛋白的利用提供理论基础。     

XRE家族转录因子XrpA调控粘质沙雷氏菌的耐酸能力

【背景】工业菌株的耐酸能力是发酵过程中的一大挑战。粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)作为肠杆菌科的一种细菌,可生成2,3-丁二醇、乙偶姻和灵菌红素等高附加值产品。然而目前对于粘质沙雷氏菌酸耐受能力的分子机制尚不清楚。【目的】通过对转录调控因子XrpA的挖掘以及对其功能的研究,探究粘质沙雷氏菌酸耐受能力的分子机制,为改善工业菌株耐酸能力提供新的策略。【方法】通过对粘质沙雷氏菌进行转座子插入突变,构建了一个Tn5G转座子插入突变文库,利用文库筛选了一株酸敏感型突变株,并对其进行测序鉴定;同时还对突变菌株中与耐酸相关关键基因的转录水平以及细胞膜通透性、细胞膜完整性和H+-ATPase的活性变化进行检测。【结果】发现了一个响应酸胁迫的转录调控因子BVG90_23400,其属于XRE超级家族转录调控因子,命名为XrpA。在酸性条件下,与野生型菌株(JNB5-1)相比,xrpA被阻断后导致了粘质沙雷氏菌多种表型的变化,其中包括生物量显著下降、H+-ATPase活性降低、细胞膜的通透性以及完整性受到破坏。【结论】 XrpA影响粘质沙雷氏菌耐酸能力的分子机制是通过对细胞膜通透性、细胞膜完整性以及H+-ATPase活性的正向调节来维持细胞在酸性条件下的内环境稳态。同时,XrpA可以通过调节酸性应激反应基因的转录水平来影响细胞内环境稳态,从而调控粘质沙雷氏菌对低pH的耐受能力。     

粘质沙雷氏菌发酵生产D-乳酸的研究

本文对粘质沙雷氏菌发酵生产D-乳酸进行了研究。以粘质沙雷氏菌G1(Serratia marcescens G1)为出发菌种,摇瓶试验确定了发酵培养方式:前12 h为菌体生长阶段,有氧培养,温度28℃,pH值7.0;后36 h为D-乳酸合成积累阶段,无氧培养,温度44℃,pH值6.0。且发现使用葡萄糖为碳源时更有利于D-乳酸的合成积累。采用缺失2,3-丁二醇合成能力的基因工程菌株R1为出发株,经筛选后得到耐受较高浓度乳酸盐的菌株R150,以R150为发酵菌种,在3.7 L发酵罐上采用两阶段发酵法,并通过增加起始菌体浓度的方法,发酵生成的D-乳酸浓度达到83.5 g/L,光学纯度达到98.9%。本研究成果为使用粘质沙雷氏菌发酵生产D-乳酸的深入研究打下了基础。     

苹果树腐烂病菌细胞色素P450基因Vmcyp5的功能

【目的】研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关。论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。【方法】通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southern blotting验证得到单拷贝敲除突变体。将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体。最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用q RT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平。【结果】通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体。与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3%。q RT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低。重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5%。互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平。【结论】Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。     

温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响

【目的】研究粘质沙雷氏菌(Serratia marcecens JNB5-1)在不同发酵温度(28℃和37℃)条件下蛋白质组的差异表达,探究粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度调控的原因。【方法】利用二维凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术(MALDI-TOF-MS)分离和鉴定粘质沙雷氏菌在不同发酵温度(28℃和37℃)条件下的差异蛋白;再利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进一步分析挑选出的七个差异蛋白编码基因的转录水平。【结果】2-DE图谱显示,共鉴定到16个显著差异的蛋白点。其中,灵菌红素合成途径中的氧甲基转移酶(PigF)、氧化还原酶(PigN)和参与灵菌红素前体物质(脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、二辛烯醛和丙二酰-CoA等)代谢的相关蛋白(酶)的表达量在37℃条件下都出现极显著的下降;热休克蛋白(Hsp60)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)等应急性蛋白在37℃条件下表达上调。通过RT-qPCR证实,氧甲基转移酶、氧化还原酶和转酮醇酶基因(transketolase)在37℃条件下的转录水平均低于28℃条件下的。【结论】S.marcecens JNB5-1在相对低温(28℃)条件下产灵菌红素,相对高温(37℃)条件下不产灵菌红素。可能是高温(37℃)显著抑制了灵菌红素合成相关酶的表达。     

防御假单胞菌双突变体H78ΔrsmA/E中hmgA基因对藤黄绿菌素生物合成的抑制

【背景】防御假单胞菌(Pseudomonas protegens) H78是分离于油菜根际的一株生防菌,其能合成藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)等多种广谱抗生素,H78的rsmA/E双突变体中Plt合成被完全抑制。【目的】通过转座子诱变技术,筛选H78ΔrsmA/E双突变体中重新激活Plt合成的下游调控因子。【方法】通过同源重组的方法在pltL基因下游插入红色荧光蛋白(redfluorescentprotein,RFP)基因来指示Plt操纵子表达的激活情况;利用转座子随机插入突变、半随机PCR技术筛选并定位目标基因;通过基因回补等方法进一步验证基因功能。【结果】从约2万株H78ΔrsmA/E的转座子突变体中筛选到一株高产Plt和某种黑色素的菌株,并确定其插入位点为hmgA基因,hmgA基因回补能重新抑制H78ΔrsmA/E的Plt合成。【结论】假单胞菌双突变体H78ΔrsmA/E中hmgA基因对Plt的合成存在强烈抑制作用,是潜在的RsmA/E下游调控基因。本研究为进一步阐明Plt合成的调控机制与网络及通过基因工程提高Plt产量奠定了基础。     

谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶G359D突变解除赖氨酸与苏氨酸协同抑制的研究

天冬氨酸激酶(Aspartate Kinase,AK)是赖氨酸合成途径中关键酶,其受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制,旨在发现其解除协同抑制的新突变体并解析其机理。通过对赖氨酸高产菌Corynebacterium glutamicum ZL5与野生型C.glutamicumATCC 13032的天冬氨酸激酶氨基酸序列比对,发现在高产菌的天冬氨酸激酶中存在G359D突变。通过体外天冬氨酸激酶野生型和G359D突变体酶活检测,发现该G359D突变体在10 mmol/L赖氨酸和苏氨酸同时存在时仍保留了76.94%±1.61%的酶活,而野生酶的酶活仅残留4.38%±1.28%。这一结果在赖氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌的回复突变中也可得到验证,其回复突变后使赖氨酸产量下降15.57%。通过同源建模和结构分析发现,与野生酶相比,G359D突变体结合赖氨酸后,其位于活性中心附近的Arg151与Glu74之间无法形成离子键,允许底物分子的结合而具有较高活性。发现天冬氨酸激酶G359D突变体可阻断赖氨酸引起的别构效应,从而有效解除赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。     

一株高产PLC的CW-W-90-3菌的鉴定

198 9年 ,筛选了 1株高产 phospholipaseC(PLC)的CW W 90 3菌株[1,2 ] ,据其形态特征、生理生化反应 ,初步将其归于弧菌科气单胞菌属[3 ] ,由于该菌株的许多生理生化特性与粘质沙雷氏菌相同。但其极生单鞭毛和无色素及少许生理生化特性与粘质沙雷氏菌相异。后经AutomatedBacteriaIdentificationSystem BiologMicroStationSystem检测 96种C源和N源的利用及其个体群体发育 ,说明其与粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescens)相符 ;并在基因组水平上研究该菌株的系统发育 ,从分子水平上对该菌株进行 16SrRNA序列分析煌同源性比较。根据CW W 90 3菌株 16SrRNA与GeneBank数据库中Serratiamarcescens的 16SrRNA的序列具有 99%的同源性 ,终将CW W 90 3菌株鉴定为粘质沙雷氏菌武汉株 (SerratiamarcescensWuhanstrain)。     

东亚飞蝗虫病原褪色沙雷氏菌的鉴定与检验北大核心CSCD

病原褪色沙雷氏菌的有效分离与鉴定对控制由褪色沙雷氏菌引起的养殖东亚飞蝗感染病均具有一定的参考与应用价值,同时将为对蝗灾的生物防治研究提供借鉴。对从发病死亡的养殖东亚飞蝗中分离的10株细菌,进行了表观分类学指征、16S r RNA基因序列与系统发育、人工感染的致病作用等方面的检验与分析。结果表明为沙雷氏菌属的褪色沙雷氏菌,对供试养殖东亚飞蝗显示强致病性。褪色沙雷氏菌对东亚飞蝗有强致病性,是蝗虫养殖的重要致病菌。     

脱落酸负调控拟南芥对白粉菌的穿透后抗性

脱落酸(ABA)在植物抗病反应中发挥重要的作用,而其如何调控植物与活体营养型病原真菌的相互作用还不清楚.拟南芥(Arabidopsis thaliana)ABA合成缺陷型突变体aba2-1和aba3-1对活体营养型病原真菌白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)的抗性增强.外源ABA处理能够增加拟南芥对白粉菌的感病性.ABA受体组分的突变体abi1-1和abi2-1对白粉菌的抗性表型与ABA合成缺陷型突变体相似,而ABA信号转导下游组分的突变体abi3-1,abi4-1和abi5-1对白粉菌的抗性表型却与野生型相似.显微观察发现,在ABA合成缺陷型突变体中白粉菌侵染的穿透前和穿透过程都没有受到影响,但其穿透后菌丝的生长及分生孢子的产量都受到抑制.另外,还发现水杨酸和MPK3参与了ABA对白粉病抗性的调控.综上所述,本研究结果显示,ABA可能通过拮抗水杨酸抗病信号通路来负调控拟南芥对白粉菌的穿透后抗性.     

东亚飞蝗虫病原褪色沙雷氏菌的鉴定与检验

病原褪色沙雷氏菌的有效分离与鉴定对控制由褪色沙雷氏菌引起的养殖东亚飞蝗感染病均具有一定的参考与应用价值,同时将为对蝗灾的生物防治研究提供借鉴。对从发病死亡的养殖东亚飞蝗中分离的10株细菌,进行了表观分类学指征、16S r RNA基因序列与系统发育、人工感染的致病作用等方面的检验与分析。结果表明为沙雷氏菌属的褪色沙雷氏菌,对供试养殖东亚飞蝗显示强致病性。褪色沙雷氏菌对东亚飞蝗有强致病性,是蝗虫养殖的重要致病菌。