香鱼巨噬细胞炎性蛋白-2基因的克隆、序列分析及表达

巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)是一种重要的趋化因子,可趋化中性粒细胞到炎症部位,从而消除炎症反应。从香鱼巨噬细胞转录组测序中获得MIP-2基因,阅读框序列长为318个核苷酸,编码一个由105个氨基酸组成、相对分子质量为11.6kD的前体蛋白。N端19个氨基酸为信号肽序列。氨基酸序列分析表明,香鱼MIP-2与白斑狗鱼MIP-2的氨基酸同源性最高,为54%。健康香鱼MIP-2基因mRNA主要在脾、肾、脑、鳃中表达,在肝、心、肌肉、肠中表达量次之。实时荧光定量PCR结果显示,鳗利斯顿氏菌侵染香鱼后,各组织中MIP-2基因mRNA表达量均呈上调趋势。尤其以肾组织和肌肉组织中变化最显著。以上结果表明,香鱼MIP-2基因表达与鳗利斯顿氏菌的侵染密切相关,揭示了MIP-2可能在香鱼抗菌免疫反应中具有重要的作用。     

香鱼TGF-β1基因的克隆及其表达与鳗利斯顿氏菌感染的相关性

通过转录组测序的方法,获得香鱼的TGF-β1基因序列,由1134个核苷酸组成,包括一个大的开放阅读框,编码成377个氨基酸组成的前体蛋白,分子量大小为43 kDa,等电点为8.72。N端前19个氨基酸为信号肽,成熟肽由C末端112个氨基酸组成,分子量大小为12.5 kDa。序列比对表明香鱼与虹鳟同源性最高,前导肽为72%,成熟肽为93%。在健康香鱼中,TGF-β1基因在肝、脾、肾、脑、肌、肠、鳃、心组织中均有表达,在肾组织中表达量最高。鳗利斯顿氏菌侵染香鱼组织后,各组织中的TGF-β1基因mRNA表达量均显著上调,肾组织中变化最为显著,注射12h时为对照组的14.5倍。构建了原核表达质粒pET-28a-TGF-β1,并制备了多克隆抗血清,能与目的蛋白TGF-β1起特异性反应,但不与细菌蛋白自身反应。以上结果表明,香鱼TGF-β1基因表达变化与鳗利斯顿氏菌的侵染相关,揭示了TGF-β1可能在鱼类抗细菌的急性期免疫应答过程中发挥作用。     

香鱼凝血因子X基因表达与鳗利斯顿氏菌感染的相关性

凝血途径的关键因子——凝血因子X(coagulation factor X,FX),是一种与免疫调控密切相关的维生素K依赖型丝氨酸蛋白酶.该研究克隆了香鱼(Plecoglossus altivelis) FX基因全长cDNA序列,它由1817个核苷酸组成,包含一个大的开放阅读框,编码一个由453个氨基酸组成的相对分子质量为5.07×104的蛋白.香鱼FX与已知的哺乳动物FX的结构相似,N端24个残基为信号肽序列.序列比较表明,香鱼FX与斑马鱼FX的氨基酸同一性最高,为53％.在健康香鱼中,FX基因mRNA主要在肝组织中表达,脑和鳃中也有少量表达.实时荧光定量PCR分析揭示,鳗利斯顿氏菌感染后香鱼肝组织中FX基因mRNA表达显著上调,16h时达到5.43倍.通过原核表达系统表达了香鱼FX丝氨酸蛋白酶结构域,并制备了抗血清.Western blotting分析显示,鳗利斯顿氏菌感染后香鱼血清中FX含量显著增加,并随着时间延长上调倍数不断增大,在36h时达到3.68倍.据此,FX基因mRNA及蛋白的表达与鳗利斯顿氏菌感染香鱼的过程紧密相关,揭示它可能在鱼类抗细菌感染的免疫反应中起重要作用.     

香鱼 HMGB1克隆、序列分析及表达特征

高迁移率族蛋白B1（High mobility group box protein 1, HMGB1）属于晚期细胞因子,与炎症反应相关。为研究香鱼HMGB1在鳗利斯顿氏菌感染引起的炎症反应中的作用,采用随机测序从肝脏组织cDNA文库中获得HMGB1基因,全长1233 bp,编码一个由204个氨基酸组成的23.3 kDa的蛋白。分析表明,该蛋白与胡瓜鱼HMGB1蛋白同源性最高。健康香鱼HMGB1基因在肌肉、脑和肝脏组织中表达量最高,而在鳃和肠中几乎不表达。 qRT-PCR表明,鳗利斯顿氏菌感染过程中,香鱼肌肉、脑和肝脏组织中HMGB1基因表达显著上调,分别在72、48 h达到峰值。原核表达香鱼HMGB1重组蛋白并制备抗血清,Western blot显示,抗血清能与目的蛋白起特异性反应,能用于研究HMGB1蛋白表达变化,进一步揭示HMGB1基因与鳗利斯顿氏菌感染引起的炎症晚期反应相关性。     

宁海地区香鱼弧菌病病原菌鉴定

摘要：【目的】香鱼弧菌病对中国沿海地区的香鱼养殖业造成了巨大的危害,然而,病原不明导致了防治上的许多问题。本文鉴定了引起宁海地区香鱼爆发性弧菌病的病原。【方法】采用TCBS平板分离优势菌;采用回归感染试验确认病原菌,采用改进的寇氏法计算LD50;采用形态学观察、生理生化特征测定、细菌特异性引物PCR扩增检测及细菌16S rRNA和金属蛋白酶（MP）基因序列分析鉴定细菌;采用药敏实验测定它对部分抗生素的敏感性。【结果】分离并鉴定优势菌株ayu-H080701为宁海地区香鱼弧菌病的病原菌,它对香鱼的半致死量为1.2×104 CFU。形态学观察和生理生化特征测定表明,ayu-H080701与鳗利斯顿氏菌最为接近。PCR扩增检测表明,细菌16S rRNA 基因通用引物和鳗利斯顿氏菌MP基因特异引物均能扩增到预期大小的特异性条带。ayu-H080701与鳗利斯顿氏菌16S rRNA基因核苷酸序列同源性最高,为99.4%～99.5%,与同属的海弧菌和美人鱼发光杆菌分别为94.3%和91.9%;ayu-H080701与鳗利斯顿氏菌MP氨基酸序列同源性高达97.6%～98.8 %,与其它弧菌科成员则低于75.6 %,系统进化树分析也揭示ayu-H080701与鳗利斯顿氏菌进化相关性最高。【结论】引起宁海地区香鱼弧菌病的菌株ayu-H080701被鉴定为鳗利斯顿氏菌。     

香鱼镉胁迫相关基因UraD的特征和表达分析

2-氧-4-羟基-4-羧基-5-脲基咪唑啉脱羧酶(UraD)是嘌呤代谢反应酶,目前鱼类UraD基因仅在斑马鱼等少数物种得到克隆分析。从香鱼克隆获得UraD的cDNA序列,全长为967 bp,编码一个由174 aa组成的分子量为19.6kDa的蛋白,等电点为5.42。系统进化树分析显示香鱼UraD位于鱼类UraD簇中,与爬行类和哺乳类的亲缘关系较远,香鱼与斑马鱼UraD的蛋白序列相似性最高达70%。香鱼UraD表达经过反转录PCR(RT-PCR)检测发现在香鱼肝、心和肠中具有较高表达。香鱼肝组织中UraD表达量经过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测,发现镉胁迫下显著减少,香鱼UraD表达在盐度胁迫和鳗利斯顿氏菌感染下表达量保持不变。上述结果揭示香鱼UraD基因的基本特征,说明香鱼UraD基因表达与镉胁迫密切相关。     

香鱼hepcidin基因的克隆、序列分析及组织表达特征

Hepcidin是一类富含半胱氨酸的抗菌肽,在鱼类非特异性免疫中起重要作用,具有调节铁代谢的功能。该研究克隆了香鱼hepcidin基因cDNA序列,全长763个核苷酸,包含一个完整的开放阅读框,推测编码一个由85个氨基酸组成的相对分子质量为9.7k的多肽,N端24个氨基酸是信号肽序列。香鱼hepcidin的成熟肽序列由25个氨基酸组成,含有8个半胱氨酸,可形成4个分子内二硫键结构。系统进化树分析表明,hepcidin的物种进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼hepcidin位于鱼类hepcidin簇中,与大西洋鲑hepcidin的亲缘关系最近,达60%。香鱼hepcidin在肝脏中表达量最大,在脾、肾、心脏和肌肉中也有表达。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)感染以后香鱼肝组织中hepcidin基因mRNA表达量显著增加,在12h增加了8.26倍。hepcidin基因可能在香鱼抗外界病原物感染过程中起重要作用。     

香鱼精氨酸酶Ⅱ基因的cDNA克隆及其表达与鳗弧菌感染的相关性

精氨酸酶II(arginase II,Arg-II)是精氨酸酶的一种,不仅可以参与机体尿素循环,还与机体病理过程密切相关。通过香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组测序获得香鱼Arg-II基因全长c DNA序列,结果表明,Arg-II基因由4 707个核苷酸组成,包含一个大的开放阅读框,编码348个氨基酸,预测分子量为38.09 k D,等电点为6.15。氨基酸序列多重比对结果显示,香鱼Arg-Ⅱ具有典型的Arg-Ⅱ结构特征,与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)Arg-Ⅱ同源性最高,为85.3%;系统进化树分析表明,鱼类Arg-Ⅱ形成一个大簇,香鱼Arg-Ⅱ与虹鳟Arg-Ⅱ进行相关性最高。实时荧光定量PCR(quantitive real-time PCR,q RTPCR)结果显示,香鱼Arg-Ⅱ基因m RNA主要在健康香鱼肝、脑、头肾和单核/巨噬细胞中表达;鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后,香鱼肝、脑、头肾和单核/巨噬细胞Arg-Ⅱ基因m RNA的表达量显著上调。综上,香鱼Arg-Ⅱ基因的表达与鳗弧菌感染紧密相关,揭示其可能在鱼类抗感染免疫应答中发挥重要作用。     

香鱼主要组织相容性复合体MHCIIB的分子克隆及其在鳗弧菌感染下的功能鉴定

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex classⅡ, MHC Ⅱ)在脊椎动物免疫反应中发挥重要作用。本研究从香鱼(Plecoglossus altivelis) 单核/巨噬细胞(monocytes/ macrophages,MO/MФ)转录组中获得了MHC II基因β链(PaMHCIIB) cDNA序列。PaMHCIIB由920个核苷酸组成,包含一个大的开放阅读框,编码251个氨基酸,预测分子质量为28.23 kD。氨基酸序列分析表明,PaMHCIIB具有MHC IIB的典型特征,主要包括信号肽、2个胞外区和1个保守的connecting peptide/transmembrane/cytoplasmic (CP/TM/CYT)结构域,与北极红点鲑(Salvelinus alpinus) MHC IIB同源性最高,为65.04%;系统发育分析表明,PaMHCIIB与北极红点鲑MHC IIB进化相关性最高。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)结果显示,PaMHCIIB mRNA主要在香鱼鳃、肠和脾中表达;鳗弧菌感染(Vibrio anguillarum)后香鱼肝中PaMHCIIB mRNA在感染后12 h(hours post infection, hpi)时上调显著,在24 hpi达到峰值,为对照组的3.18倍,脾、头肾、肠和鳃中PaMHCIIB mRNA均在4 hpi时上调显著,分别在4、8、24和12 hpi时达到峰值,分别为对照组的85.18、2.06、4.21和6.81倍(P<0.05)。香鱼MO/MФ经鳗弧菌感染后,PaMHCIIB mRNA的表达水平在4 hpi时上调显著,在12 hpi时达到峰值,为对照组的3.35倍(P<0.05)。原核表达了PaMHCIIB胞外区并制备其抗体。Western 印迹分析结果表明,香鱼MO/MФ中PaMHCIIB具有N糖基化修饰,且鳗弧菌感染后其蛋白表达水平在12 hpi时显著增加,在24 hpi时达到峰值,为对照组的3.19倍(P<0.05)。抗体封闭PaMHCIIB后,香鱼MO/MФ吞噬活性被抑制,为对照组的0.28倍(P<0.05),而且鳗弧菌诱导的4个细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β表达均受到抑制,均在8 hpi时被抑制最明显,表达量分别为对照组的0.23、0.41、0.51和0.20倍(P<0.05)。本研究结果揭示PaMHCIIB可能参与香鱼MO/MФ抵抗病原菌感染的免疫防御。     

蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的克隆及表达分析

采用筛选cDNA文库的方法,首次克隆了蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy的全长cDNA序列和DNA序列,序列分析表明,蝗绿僵菌氰化物水合酶基因MaChy不含内含子,开放阅读框（ORF）为1,074bp,编码357个氨基酸,推测蛋白的分子量为39.78kDa,等电点（pI）为5.53;利用在线软件分析表明,该蛋白既不是分泌型蛋白也不是膜蛋白;同源性比对结果表明,该蛋白与其他真菌中的氰化物水合酶蛋白的同源性较高,具有高度保守的催化三联体特征。用qRT-PCR方法分析了该基因在蝗绿僵菌侵染昆虫过程中的表达情况,结果表明,MaChy在蝗绿僵菌侵染穿透昆虫体壁阶段的表达量最高,约为体内阶段表达量的2.5倍,推测该基因可能在蝗绿僵菌穿透昆虫体壁的过程中起重要作用。     

Increased liver protein and mRNA expression of natural killer cell-enhancing factor B (NKEF-B) in ayu (Plecoglossus altivelis) after Aeromonas hydrophila infection

Natural killer cell-enhancing factor (NKEF) may mediate cellular responses to proinflammatory molecules. The liver proteins of Aeromonas hydrophila-infected ayu (Plecoglossus altivelis) and healthy control fish were analyzed by 2DE. A protein, which increased significantly in diseased fish, was identified as NKEF-B by MALDI-TOF-MS. A full-length cDNA clone of this protein was subsequently isolated. It contains 1092 bp with an open reading frame of 591 bp, coding for 197 amino acids with MW 21.9 kDa and pI 6.38, values similar to those determined by 2DE. Ayu NKEF-B had highest similarity (93.1% amino acid identity) to those of carp and zebrafish. Phylogenetic analysis showed that ayu NKEF-B falls into the fish NKEF-B cluster and is most closely related to that of carp and zebrafish. It was determined that ayu NKEF-B mRNA expression was significantly increased in many tissues at the early stage of bacterial infection. In conclusion, the increased NKEF-B mRNA and protein expression in ayu were closely associated with A. hydrophila infection.