悬钩子属植物肌动蛋白基因片段的克隆与表达

目的:克隆悬钩子属植物肌动蛋白基因(actin),为研究该物种中其他基因的表达和调控提供内标基因.方法:利用一对特异性引物从黑莓、悬钩子杂种和树莓品种中克隆actin cDNA片段,对其进行序列分析和半定量RT-PCR表达分析.结果:从3个品种中均获得一条783 bp actin cDNA片段,编码260个氨基酸,3条actin片段与其他植物核苷酸序列的同源性都在82%以上,与其他植物氨基酸序列同源性也均在95%以上;树莓和悬钩子杂种品种的actin核苷酸和氨基酸序列同源性均达99%,系统进化分析也发现两者亲缘关系较近些;表达分析发现actin基因在各品种不同组织中均有一定的表达量.结论:首次克隆了悬钩子属植物肌动蛋白基因actin,将来自黑莓和树莓品种的序列登录在GenBank,登录号分别为HQ439556和HQ439557.     

利用简并引物克隆黑莓、树莓肌动蛋白基因片段及表达分析

采用同源克隆法,利用设计的一对肌动蛋白(actin)基因简并引物,从黑莓、树莓和悬钩子杂种3个悬钩子植物品种均得到一条743 bp的actin cDNA片段,推测编码247个氨基酸.序列比对发现,克隆的actin基因推导的氨基酸序列和其他植物的肌动蛋白氨基酸序列具有高度保守性,经数据库搜索后将来自黑莓和树莓品种的actin cDNA片段在GenBank中登录,登录号分别为HQ439558和HQ439559.不同来源的植物actin蛋白系统进化树的聚类结果表明,树莓和悬钩子杂种亲缘关系较为密切.actin基因在3个悬钩子植物品种不同组织中的RT-PCR分析结果表明,其在检测的不同组织中均有一定程度的表达量,可能都属于组成型表达的肌动蛋白基因.研究结果为利用actin基因作为内参进一步研究黑莓和树莓其他基因的丰度奠定基础.     

大乳头水螅RACE cDNA文库的构建

目的:为筛选和克隆大乳头水螅发育调控相关基因的全长cDNA,构建大乳头水螅RACE cDNA文库.方法:提取大乳头水螅总RNA后从其中分离mRNA,运用SMART技术构建RACE cDNA文库.为鉴定所构建文库的质量,根据GenBank中大乳头水螅actin基因cDNA序列设计5'RACE和3'RACE的引物及用于扩增actin基因编码区全长序列的引物.结果:琼脂糖凝胶电泳结果表明,RACE cDNA文库中全长cDNA的长度集中在500-2 000bp之间.5'RACE、3'RACE PCR及扩增actin基因编码区全长序列时均以本文构建的大乳头水螅RACE cDNA文库为模板,这3个PCR反应均能扩增出产物,产物大小与目标片段预计大小相似.PCR产物分别经T/A克隆及测序后证明为大乳头水螅actin基因cDNA的相应序列.结论:RACE cDNA文库的成功构建为通过RACE方法获得大乳头水螅功能基因cDNA全长序列奠定了基础.     

蒙古牛BMPR-IB基因部分cDNA的克隆和序列分析

BMPR-IB基因主要在哺乳动物卵巢中表达,对卵泡的发育和分化起重要作用。该研究从影响卵巢生长发育和调控的BMPR-IB基因出发,以牛卵巢的RNA为模板,按照不同物种BMPR-IB基因的相似性设计特异引物,运用RT-PCR技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMPR-IB序列,包含有953bp组成的部分cDNA序列,同源性分析结果表明,牛BMPR-IB基因序列与绵羊、山羊、人、猪、小鼠的BMPR-IB基因分别为98%、97%、92%、93%、88%的同源性。这为克隆其他物种的BMPR-IB基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为更好地理解牛的生殖机理提供帮助。     

草莓果实MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

根据多种植物MADS-box基因保守区序列设计简并引物,应用PCR技术从草莓绿果中分高出33条MADS-box基因cDNA片段.序列分析表明,这些片段长度在137 - 146 bp之间,包含基因起始密码子.推导的氨基酸序列与已登录的草莓的MADS-box基因同源性超过87％.推导的氨基酸序列与已知的革莓和其他物种调控果实发育成熟的MADs-box基因以及拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分科归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明草莓果实中存在各类MADS-box家族基因,克隆的部分片段可能参与调控果实发育和成熟软化的调节.     

抑制差减杂交法分离玉米幼苗淹水诱导表达基因

以淹水处理(submergence-treated, ST)的玉米(Zea mays L.)幼苗根部cDNA为目标群体,未处理(untreated, UT)的玉米幼苗根部cDNA为对照群体,进行抑制差减杂交.用经过UT差减的ST cDNA构建了一个含有大约2 000个独立克隆的差减文库.对随机挑取的408个克隆进行差异筛选,获得了184个在ST中特异表达或表达增强的候选克隆.对其中155个cDNA克隆测序并去除重复克隆后,共得到95个差异表达的cDNA片段.GenBank中BLAST查询结果表明:6个克隆为已知的玉米核苷酸序列;68个克隆与已知基因或EST序列部分区域的同源性为60%～90%;21个克隆在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因,或者由于序列位于变异丰富的3′端而无法查到与其他物种基因的同源性.     

光叶楮肌动蛋白基因片段的克隆及其序列分析

目的:克隆构树Actin基因,为在分子生物学中研究外源基因在构树中的表达提供内参,为克隆和分析桑科其它植物的actin基因提供参考。方法:根据GenBank中一桑科植物桑树Actin基因的EST序列,设计引物,提取构树叶片总RNA,通过RT-PCR克隆目标片段。结果:获得一段大小为238bp的基因片段,经测序、同源性比较,这条片段的EST序列与桑树Actin基因、巴旦杏Actin基因的核苷酸同源性分别为96%、92%;氨基酸序列的同源性则分别为100%、98.73%。结论:通过实验结果分析表明获得了构树actin基因EST序列。     

斯达氏油脂酵母肌动蛋白基因克隆及序列分析

以产油真菌斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi AS 2.1560)为材料,提取总KNA,反转录成cDNA.根据真菌肌动蛋白(actin)保守核酸序列设计引物,PCR扩增后获得部分序列,再采用cDNA末端快速扩增技术获得了开放阅读框全长为1128 bP的cDNA序列,该序列编码蛋白质含375个氨基酸残基,等电点为5.49.同源性比较发现该基因(Accession No.EU258762)与其它已知真菌的actin基因相似性在75%以上,氨基酸序列相似性在90%以上.通过不同物种肌动蛋白进化树分析发现L.srarkeyi与亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)有较近的亲缘关系.该研究对探索L.starkeyi产油机制有一定的参考价值.     

玉米自交系干旱应答基因的鉴定

为开发耐旱分子选择标记提供有用信息,用mRNA差异显示技术分离耐旱玉米自交系‘81565’在干旱胁迫与灌溉对照之间差异表达的基因,发现MD1、MD2和MD3三个在干旱胁迫下差异表达的片段。MD1和MD2为下调表达,MD3为上调表达。序列分析和同源性比对表明,MD1与编码成熟酶的玉米叶绿体基因matK有97％的相似性,MD2与极端耐旱植物Sporobolus stapfianus编码丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶的PP2C基因有99％的相似性,MD3与属精氨酸／赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶类的水稻metacaspase酶基因有99％的相似性。根据MD2片段序列,结合电子克隆和RT-PCR方法,克隆出一条1731bp的全长cDNA序列,它编码388个氨基酸。此氨基酸序列包含丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酶2C的催化中心结构域,被认定为玉米PP2C基因族的新成员,命名为ZmPP2Ca。实时荧光定量PCR结果表明,在干旱胁迫下,ZmPP2Ca基因在3个耐旱自交系中呈下调表达,在2个不耐旱自交系中呈上调表达。     

以绵羊MHC区段BAC克隆酶切片段为探针杂交筛选绵羊混合组织cDNA文库

在已知中国美利奴羊MHC(Major histocompatibility complex)区段BAC(Bacterial artificial chromosome)克隆序列信息和预测的基因注释前提下,用位于中国美利奴羊基因组BAC文库MHC区段的6个BAC克隆酶切片段为探针,以噬菌斑原位杂交筛选法筛选中国美利奴羊混合组织cDNA文库(库库杂交),对分离到的cDNA阳性克隆进行全序列测定,并与相应的已知序列信息和基因注释的BAC克隆比对以及在NCBI Blastn数据库中序列相似性检索,旨在验证基因注释结果的准确性和对基因(序列)功能的初步分析。实验中,经过两轮杂交共筛选出27个cDNA阳性克隆(序列),并发现这些序列均可定位到相应的BAC克隆上,且25条序列处在注释基因的外显子部分;在NCBI数据库中经Blastn序列相似性检索发现,23条序列与牛基因的序列相似性最高,且与免疫功能密切相关。