砂仁对抗生素所致肠道菌群失调小鼠调节作用的探讨

【摘要】 目的 通过建立抗生素诱导小鼠肠道菌群失调模型,应用PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术分析小鼠肠道菌群失调前后经服用中药砂仁调理后肠道菌群指纹图谱的变化。方法 选用10只昆明种小鼠,正常培养7 d,适应环境后每天取粪便1次,连续3 d;菌群稳定后按100 mg/kg的头孢拉啶灌胃,每天灌胃2次,连续5 d,每天取粪便1次;上述小鼠随机分为两个组,自然恢复组(饲喂基础饲料)和砂仁处理组,每组5只。3 d后每天取粪便1次,连续3 d,提取细菌总DNA,以16S rRNA基因V3区通用引物扩增,对扩增的PCR产物进行DGGE电泳及指纹图谱分析并切胶测序比对。结果 抗生素处理后小鼠肠道菌群与正常小鼠差异有统计学意义,致病菌增加,砂仁处理组小鼠与正常小鼠的肠道菌群指纹图谱有很大的相似性,但与自然恢复组差异有统计学意义。结论 抗生素可导致小鼠肠道菌群失调,而中药砂仁对肠道菌群失调有明显的恢复作用。     

ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析壳聚糖对抗生素引起肠道菌群失调小鼠的影响

目的应用肠杆菌基因间重复共有序列基因扩增(ERIC-PCR)和聚合酶链式反应——变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析壳聚糖对抗生素致肠道菌群失调小鼠的影响。方法 SPF级昆明小鼠24只,每组8只,依次分为模型组(N)、壳聚糖高(CS-H)和低浓度组(CS-L),盐酸左氧氟沙星灌胃6d后使用相应药物灌胃24d,收集鼠便,提取粪便细菌DNA,利用ERIC-PCR和PCR-DGGE电泳获得肠道菌群指纹图谱,主成分分析(PCA)和聚类分析(UPGMA)研究肠道菌群整体差异,并鉴定优势条带序列。结果 ERIC-PCR表明菌群失调组小鼠肠道中细菌条带减少明显,以300bp左右的条带为特征条带,PCR-DGGE显示屎肠球菌为优势菌型;壳聚糖灌胃小鼠肠道菌群结构组成发生改变,乳酸菌成为优势菌型。结论壳聚糖扶持乳酸菌等益生菌、抑制肠球菌等病原菌的增殖,起到益生元的作用进而调节肠道微生态均衡。     

ERIC-PCR指纹图谱技术分析糖尿病小鼠肠道细菌群落变化

目的通过比较1型糖尿病模型组和空白对照组雄性小鼠肠道菌群结构的变化,探索糖尿病造模与肠道菌群的关系。方法收集造模2周后空白对照组(n=5)、STZ造模成功组(n=5)和造模不成功组(n=3)ICR小鼠的新鲜粪便样品,提取粪便样品的总DNA,ERIC-PCR扩增形成DNA指纹图谱,借助多变量统计分析方法研究各组样品肠道菌群结构上的异同。结果ERIC-PCR指纹图谱结合偏最小二乘法(PLS-DA)分析表明造模成功组和造模不成功组小鼠的肠道菌群结构显著区别于空白对照组,而造模不成功组小鼠的肠道菌群结构与造模成功组仍有一定的区别。结论STZ诱导的1型糖尿病会造成小鼠的肠道菌群结构的变化,而部分小鼠造模失败可能与这些小鼠的肠道菌群结构有关。     

茶多酚的提取及其对抗生素所致肠道菌群失衡的调整和预防作用

为评价茶多酚对抗生素所致小鼠肠道菌群失衡的调整和预防作用,采用ZnCl2沉淀,乙酸乙酯萃取法提取茶多酚,HPLC检测提取效果;将BALB/c小鼠随机分为正常对照、失调模型、预防和治疗组,定期留取粪便,以自主改进法提取粪便细菌基因组总DNA,PCR-DGGE获得肠道菌群分子指纹图谱,进行相似性、多样性及主要差异条带序列的分析。结果表明提取茶多酚中有效成分EGCG的含量为42.67%;改进的溶菌酶法可有效对粪便细菌总DNA进行提取并保证下游分析顺利开展;DGGE分析显示治疗组和预防组电泳条带与正常对照组比较差异较小(P0.05),提示茶多酚对抗生素所致肠道菌群失衡具有一定的调整和预防作用,预防效果更佳。     

大蒜素对急性酒精性肝损伤小鼠 肠道菌群失调的预防作用研究

目的应用肠杆菌基因间重复共有序列基因扩增(ERIC-PCR)和聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)研究大蒜素对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的预防作用。方法 SPF级昆明小鼠40只,分为正常对照组、急性酒精性肝损伤组、护肝片组、大蒜素高和低浓度组,每组8只。灌服相应药物30d,除正常对照组,其他组灌胃14 mL/kg红星二锅头,12h后收集鼠便,提取粪便细菌DNA,利用ERIC-PCR和PCR-DGGE电泳获得肠道菌群指纹图谱,主成分分析(PCA)和聚类分析(UPGMA)研究肠道菌群整体差异并鉴定优势条带序列。结果 ERIC-PCR表明急性酒精性肝损伤小鼠肠道中细菌条带较少,以300bp和500bp左右的条带为特征条带,PCR-DGGE显示肠球菌为优势菌型;大蒜素灌胃小鼠肠道菌群结构组成发生改变,优杆菌属为优势菌型。结论大蒜素预防给药可以扶持肠道中优杆菌属等益生菌生长,抑制肠球菌等病原菌的增殖,调节急性酒精性肝损伤伴有的肠道菌群失调。     

大蒜素对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的预防作用

目的应用肠杆菌基因间重复共有序列基因扩增(ERIC-PCR)和聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)研究大蒜素对急性酒精性肝损伤小鼠肠道菌群失调的预防作用。方法 SPF级昆明小鼠40只,分为正常对照组、急性酒精性肝损伤组、护肝片组、大蒜素高和低浓度组,每组8只。灌服相应药物30d,除正常对照组,其他组灌胃14 mL/kg红星二锅头,12h后收集鼠便,提取粪便细菌DNA,利用ERIC-PCR和PCR-DGGE电泳获得肠道菌群指纹图谱,主成分分析(PCA)和聚类分析(UPGMA)研究肠道菌群整体差异并鉴定优势条带序列。结果 ERIC-PCR表明急性酒精性肝损伤小鼠肠道中细菌条带较少,以300bp和500bp左右的条带为特征条带,PCR-DGGE显示肠球菌为优势菌型;大蒜素灌胃小鼠肠道菌群结构组成发生改变,优杆菌属为优势菌型。结论大蒜素预防给药可以扶持肠道中优杆菌属等益生菌生长,抑制肠球菌等病原菌的增殖,调节急性酒精性肝损伤伴有的肠道菌群失调。     

基于16S rRNA基因和细菌基因组间重复序列的DNA指纹图谱技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道菌群多样性的研究

目的应用PCR-DGGE和rep-PCR技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道菌群多样性进行研究,探讨肠道菌群多样性的变化,并比较这两种方法在菌群分析中的作用。方法首先建立CCL4诱导肝硬化大鼠的肝移植模型,收取对照组、肝硬化成模时、肝移植后7 d和肝移植后30 d的大鼠粪便,提取细菌基因组DNA,采用PCR-DGGE和rep-PCR[BOX-PCR,ERIC-PCR,ERIC2-PCR,(GTG)5-PCR,REP-PCR]进行DNA指纹图谱分析。结果PCR-DGGE可明确将正常大鼠、肝硬化大鼠、肝移植大鼠分为3个簇,并显示出肝硬化、肝移植大鼠肠道菌群多样性明显增多。rep-PCR技术也可将各组分开,其中ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR三者扩增条带各组差异有显著性,鉴别效果更好。结论应用基于16S rRNA基因和细菌基因组间重复序列的指纹图谱技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道微生态的研究具有重要价值,可对临床肝硬化、肝移植患者肠道微生态制剂的使用起到指导作用。     

PCR-DGGE技术评价抗生素诱导的肠道菌群失调

目的 利用PCR-DGGE技术结合活菌计数评价抗生素引起的肠道菌群失调.方法 SPF级BALB/c雌性小鼠连续4 d灌胃头孢曲松溶液125 mg/ml,0.4 ml/d,运用基于细菌16S DNA的PCR-DGGE技术结合活菌计数分析小鼠肠道菌群变化.结果 活菌计数结果与PCR-DGGE图谱显示,头孢曲松处理3 d后小鼠肠道菌群出现严重失调.结论 PCR-DGGE技术可直观而灵敏地显示抗生素处理过程中肠道菌群的动态变化,适用于评价抗生素引起的肠道菌群失调.     

运动对小鼠肠道菌群的影响

目的利用PCR-DGGE方法比较运动小鼠和正常小鼠肠道菌群的结构和数量变化,研究运动对肠道菌群的影响。方法从5只正常Balb/c小鼠和5只运动C57BL/6J小鼠的粪便中提取细菌基因组总DNA,用聚合酶链式反应—变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)的方法获得小鼠肠道菌群分布图谱,对图谱进行相似性、多样性以及优势条带的序列分析。结果 PCR-DGGE结果图显示运动小鼠肠道菌群的多样性明显增加,优势菌群发生转变,序列分析表明变形菌门明显减少,厚壁菌门成为优势菌型。结论运动会对小鼠肠道菌群产生影响。     

膳食诱导肥胖大鼠模型的肠道菌群结构及其特异分子标识物

目的通过对膳食诱导肥胖（Diet Induced Obesity,DIO）大鼠与健康对照组大鼠的肠道菌群结构的分析比较,寻找造成2组大鼠菌群结构差异的分子标识物,探讨肠道菌群的组成和结构与宿主肥胖之间的关系。方法ERIC—PCR结合Southern-blot得到肠道菌群基因组指纹图谱,利用Southem-blot与多元统计方法（PCA、PLS等）找出差异条带,回收差异条带进行测序,根据序列设计特异性引物,以定量PCR法对结果进行验证。结果ERIC-PCR图谱表明膳食诱导肥胖大鼠在肠道菌群结构上与正常大鼠存在着较大的区别;根据杂交结果找到一段基因组DNA片段为膳食诱导肥胖大鼠组所特有,定量分析表明该DNA片段在2组大鼠间区别明显。结论膳食诱导肥胖大鼠所特有的一段基因组DNA片段可作为肥胖大鼠肠道的特征分子标识物,该标识物有望用于膳食诱导肥胖的机制研究中。     

基于ERIC-PCR技术研究酪蛋白糖巨肽对小鼠肠道菌群结构的影响

目的了解酪蛋白糖巨肽(CGMP)对小鼠肠道中微生物群落结构及其动态变化的影响。方法采用ER IC-PCR技术分析鉴定在灌胃小鼠CGMP期间其肠道菌群结构的变化情况。在实验的第0、3、5、7、10、15和21天(灌胃停止后1周)分别提取对照组和CGMP组小鼠粪便总DNA,以此为模板进行PCR反应,获得肠道微生物群落的ER IC-PCR指纹图谱。结果小鼠个体在一段时间内微生物群落演替不明显,群落相似性较高。对照组小鼠肠道菌群多样性指数范围为1.75±0.06,CGMP组多样性指数范围为1.89±0.04,二者之间差异有统计学意义。结论小鼠肠道内的微生物群落非常丰富,普遍存在共有的优势菌群,且优势菌群的群落结构较为稳定;CGMP能够显著增加小鼠肠道菌群的多样性;聚类分析结果显示:对照组小鼠个体在不同时间的肠道菌群结构相似性较高,且ER IC-PCR指纹图谱没有明显的规律;CGMP组小鼠个体的ER IC-PCR指纹图谱被明显地分成2个亚族,说明小鼠灌胃CGMP 3~5 d后,其肠道菌群的群落结构开始发生明显变化。     

基于PCR DGGE的小鼠肠道菌群基因组提取方法的建立

通过比较4种小鼠粪便细菌总DNA提取方法对基于PCR-DGGE检测的肠道菌群多样性分析的影响,旨在建立适于PCR—DGGE的小鼠肠道微生物宏基因组提取的稳定、经济、快捷的方法。采用SDS裂解法、某国产市售粪便DNA提取试剂盒、改进的化学裂解法、改进的溶菌酶法4种方法提取小鼠粪便细菌总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法、细菌16S rRNAV3区PCR扩增结合DGGE对提取结果进行比较分析。SDS裂解法和国产市售试剂盒2种方法提取粪便细菌总DNA均未得到理想结果,另2种方法均能够检测到粪便中20种左右的细菌。改进的化学裂解法和改进的溶菌酶提取法的建立为基于PCR—DGGE进行肠道菌群结构的定量及定性分析提供了可靠的前提基础和实验保障。     

海参多糖对小鼠肠道菌群紊乱的恢复作用

目的探究海参多糖对抗生素所致小鼠肠道菌群失衡的调整作用。方法超声浸提法提取海参多糖,硫酸-苯酚法测定多糖含量;通过抗生素连续灌胃1周,构建小鼠肠道紊乱模型;将18只昆明种小鼠随机分为正常对照、自然恢复和海参多糖干预组(每组6只),定期留取粪便,采用PCR-DGGE技术获得肠道菌群分子指纹图谱,进行相似性、多样性及主要差异条带序列的分析。结果提取海参多糖的浓度为1.92 mg/mL;正常对照组小鼠肠道菌群以有益菌,即乳杆菌属和梭菌属占主导地位;而在抗生素干预后,这两种菌的含量明显下降,并伴随检测出致病性卟啉单胞菌属;经海参多糖处理后,有益菌含量有所恢复,有害菌含量降低。结论海参多糖对抗生素所致实验小鼠肠道菌群紊乱有一定的恢复作用。     

Fingerprinting of Mixed Bacterial Strains and BIOLOG Gram-Negative (GN) Substrate Communities by Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence-PCR (ERIC-PCR)

PCR-based genomic fingerprinting by use of enterobacterial repetitive intergenic consensus primers (ERIC-PCR) was evaluated for its use in fingerprinting DNA of mixed Gram-negative bacterial strains and BIOLOG Gram-negative (GN) microplate substrate communities. ERIC-PCR fingerprints of six different pure bacterial strains and a combined mixture of the strains were compared with fingerprints obtained by two more established methods: amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) and random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD-PCR). The ERIC-PCR fingerprint of the mixed strains was highly reproducible and was more species-specific and representative of the individual strain fingerprints than the ARDRA and RAPD-PCR fingerprints, respectively. ERIC-PCR fingerprinting of model and rhizosphere BIOLOG GN substrate communities also provided clearly distinguishable fingerprints. Results of this study suggest that ERIC-PCR represents a rapid and highly discriminating method for fingerprinting DNA of mixed Gram-negative bacterial strains and BIOLOG GN substrate communities. Received: 11 September 1998 / Accepted: 29 October 1998     

组方食品对2型糖尿病小鼠血糖及 肠道菌群的影响

目的研究含有浒苔等植物的功能性食品对糖尿病小鼠血糖浓度的影响,并应用PCR-DGGE技术评价其对昆明小鼠肠道菌群稳态的影响。方法采用高脂饲料喂养昆明小鼠加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病小鼠模型;将实验动物随机分为正常对照组、自然恢复组和功能性食品喂养组,连续给药4周,尾静脉采血测量血糖水平。收集小鼠新鲜粪便,提取粪便细菌基因组DNA,通过PCR-DGGE获得细菌群落指纹图谱,并进行相关软件分析,同时切离差异显著条带进行序列分析。结果本实验采用的功能性食品对糖尿病小鼠有降糖作用,并使血糖值稳定地维持在较低水平。4周后,功能性食品喂养的糖尿病小鼠血糖水平相对普通饲料喂养的糖尿病小鼠血糖发生显著性下降(t=4.19,P0.01);给2型糖尿病小鼠提供普通饲料时,其肠道菌群种类和数目相对较少;而提供功能性食品时,肠道菌群种类和数目相对增多,特别是双歧杆菌、Prevotella oryzae、Barnesiella intestinihominis、Culturomica和Parabacteroides distasonis明显增多,但是Muribaculum较少。结论高脂饲料结合STZ诱导的2型糖尿病小鼠肠道菌群发生显著改变,组方食品通过扶持肠道菌群,降低血糖水平。     

裙带菜多糖及其寡糖对 洛哌丁胺诱导便秘小鼠的肠道菌群的影响

目的比较裙带菜多糖及其寡糖对洛哌丁胺引起小鼠便秘的肠道菌群的影响。方法给予小鼠9.6mg/kg浓度的洛哌丁胺每日2次连续灌胃14d,分别给予裙带菜多糖和裙带菜寡糖,通过PCRDGGE技术获得菌群指纹图谱和16SRNA测序,用Quantity One软件构建进化树,对图谱进行相似性及多样性分析,并选取差异条带进行测序。结果裙带菜多糖可以明显改善小鼠由洛哌丁胺引起的便秘并且增加菌群多样性,裙带菜寡糖虽然也可以改善但效果不是很明显(对便秘和菌群有改善,但差异无统计学意义)。结论裙带菜多糖及其寡糖可以(通过改善肠道菌群从而)改善由洛哌丁胺引起的便秘。     

A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens

Many carcinogens leave a unique mutational fingerprint in the human genome. These mutational fingerprints manifest as specific types of mutations often clustering at certain genomic loci in tumor genomes from carcinogen-exposed individuals. To develop a high-throughput method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens, we have devised a cost-, time- and labor-effective strategy, in which the widely used transgenic Big Blue® mouse mutation detection assay is made compatible with the Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium next-generation sequencing technology. As proof of principle, we have used this novel method to establish the mutational fingerprints of three prominent carcinogens with varying mutagenic potencies, including sunlight ultraviolet radiation, 4-aminobiphenyl and secondhand smoke that are known to be strong, moderate and weak mutagens, respectively. For verification purposes, we have compared the mutational fingerprints of these carcinogens obtained by our newly developed method with those obtained by parallel analyses using the conventional low-throughput approach, that is, standard mutation detection assay followed by direct DNA sequencing using a capillary DNA sequencer. We demonstrate that this high-throughput next-generation sequencing-based method is highly specific and sensitive to detect the mutational fingerprints of the tested carcinogens. The method is reproducible, and its accuracy is comparable with that of the currently available low-throughput method. In conclusion, this novel method has the potential to move the field of carcinogenesis forward by allowing high-throughput analysis of mutations induced by endogenous and/or exogenous genotoxic agents.